囊性纖維化呼吸道微生物組解析

發(fā)稿時間：2016-07-22來源：天昊生物

英文題目：Insights into the respiratory tract microbiota of patients with cystic fibrosis during early Pseudomonas aeruginosa colonization

中文題目：對銅綠假單胞菌定植早期的囊性纖維化患者的呼吸道微生物組進(jìn)行解析

期刊名：SpringerPlus       發(fā)表時間： 2015           

研究背景: 慢性肺部感染是囊性纖維化（CF）發(fā)病率和死亡率的主要原因。CF患者的呼吸道在早期被許多細(xì)菌定植和感染，這些細(xì)菌包括銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、洋蔥伯克氏菌、氧化木糖無色桿菌，而銅綠假單胞菌是囊性纖維化（CF）最主要的病原體。有研究表明在CF孩子患者中，銅綠假單胞菌的定植與肺功能逐漸惡化有縱向相關(guān)性，因此在早期檢測銅綠假單胞菌可以最大限度地有效控制這種病原體，而更好了解銅綠假單胞菌感染的初始步驟，將有助于防止它在CF病人呼吸道的早期定植。基于此，本文對CF患者銅綠假單胞菌定植初期的呼吸道微生物群落結(jié)構(gòu)與動態(tài)變化通過焦磷酸測序進(jìn)行了解析。

材料：5個囊性纖維化患者（CF），其年齡范圍是5–19歲，隨訪周期是16–39 個月（平均22個月），共計收集到20個痰樣本（每個病人平均4個樣本）。痰標(biāo)本質(zhì)量通過新鮮涂片細(xì)胞學(xué)檢查進(jìn)行了驗證。所有的樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對銅綠假單胞菌感染狀態(tài)進(jìn)行了鑒定，并分為兩組：3個病人被定義為‘free’ (至少在前一年沒有銅綠假單胞菌定植)；2個病人被定義為‘never’(在痰或咳嗽拭子中從沒有檢測到銅綠假單胞菌定植)。所有患者在后續(xù)隨訪中均是銅綠假單胞菌陽性。

技術(shù)：16S rRNA擴(kuò)增子測序（V3-V4）；

測序平臺：Roche 454 FLX 測序平臺

研究結(jié)果：

呼吸道微生物多樣性

結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本細(xì)菌多樣性非常高，平均Shannon指數(shù)達(dá)到3.58，這與其它相關(guān)研究得到的結(jié)果相符；Good's coverage指數(shù)(0.999)表明發(fā)現(xiàn)了大部分的細(xì)菌種類；每個樣品的Chao-1菌群豐度指數(shù)僅比實際觀察到的OTUs數(shù)目稍高，這表明真實菌群豐度沒有被低估。推測本研究發(fā)現(xiàn)高細(xì)菌多樣性是因為這些病人的年齡均非常年輕（平均10歲），據(jù)報道這個年齡段的細(xì)菌多樣性是最高的。

CF患者核心肺部菌群

共計58個OTUs構(gòu)成了CF患者核心菌群。如圖1所示，鑒定到5個門: 厚壁菌門，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和梭桿菌門。這個核心CF肺菌群是由13個主要屬構(gòu)成 (相對豐度 >1 %) ，它們的總量達(dá)到核心reads的94 % 。實際上本研究發(fā)現(xiàn)的這13個CF核心肺部菌樹在所有CF患者呼吸道微生物相關(guān)研究中都被發(fā)現(xiàn)過，其中9個菌屬還是健康人肺部豐度最高的菌屬。與以前的研究相符，本研究也發(fā)現(xiàn)了豐度較高的厭氧菌（如韋永氏球菌屬和普氏菌）和兼性厭氧菌（如麻疹），而這兩類菌被認(rèn)為是CF病人肺部惡化的生物標(biāo)記物。      

研究還發(fā)現(xiàn)屬于相關(guān)口腔微生物的細(xì)菌（例如TM6, TM7 , WPS-2）也低豐度地存在于痰樣本中，雖然TM6和WPS-2已經(jīng)被報道存在于痰樣本中，但是TM7卻是第一次被發(fā)現(xiàn)存在于痰樣本中。而在CF兒童的痰樣本中發(fā)現(xiàn)這類口腔微生物從側(cè)面也證實了一個觀點：口腔是潛在病原體的來源，例如厭氧菌，它能到達(dá)并定植在CF患者的下呼吸道。

圖1: （CF）病人核心肺部菌群的細(xì)菌多樣性系統(tǒng)發(fā)育樹。內(nèi)環(huán)不同顏色代表來自5個不同的門；每個節(jié)點代表一個核心OTUs（在50%的樣品都存在的菌群，并且相對豐度大于總細(xì)菌群落的0.1%）；外面的柱狀代表5個CF病人每個OTUs的相對豐度。

銅綠假單胞菌定植早期的CF患者呼吸道菌群動態(tài)變化

如圖2A所描繪的 ，在銅綠假單胞菌定植早期CF患者呼吸道菌群在生物量上雖然有波動，但是每個個體的菌群結(jié)構(gòu)還是相對穩(wěn)定的，可以明顯分為五組。

圖2A：5個CF患者菌群結(jié)構(gòu)的PCoA分析(患者A, 紅色倒三角; 患者B, 藍(lán)三角; 患者C, 橙色圈; 患者D, 綠色三角; 患者E, 紫色方塊)。

厭氧菌存在的持續(xù)性

隨著銅綠假單胞菌早期定植過程的進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)9個OTUs以較高的豐度持續(xù)存在于所有樣本中，這其中包括六個屬，包括3個專性厭氧菌（韋榮球菌屬、放線菌屬和普雷沃菌屬），和3個兼性厭氧菌（流感嗜血桿菌屬，顆粒鏈菌屬和鏈球菌屬）（圖 3），這說明厭氧菌在CF患者的病理生理學(xué)中發(fā)揮了重要作用，這是因為它們參與炎癥，感染和肺功能。

本研究關(guān)注的一個問題是到底是銅綠假單胞菌的植入隨后引起了厭氧菌的增殖還是反過來厭氧菌的增殖引起了銅綠假單胞菌的定植。在最初的“never”組(在痰或咳嗽拭子中從沒有檢測到銅綠假單胞菌定植)所有樣本中都檢測到相同的厭氧菌屬，幾個月以后這些人都感染了銅綠假單胞菌，這表明厭氧菌并不阻礙銅綠假單胞菌的植入。事實上，許多測序結(jié)果顯示，常見的肺部疾病除了一些眾所周知的肺部病原微生物，還存在一類核心菌群，它包括4個持續(xù)存在的厭氧菌屬（韋榮球菌屬、鏈球菌屬、放線菌、普雷沃菌屬），這表明存在一種“近墨者黑”的現(xiàn)象，即最主要病原菌對于銅綠假單胞菌群的植入起決定性作用，然而這四個菌屬作為銅綠假單胞菌植入促進(jìn)劑的作用仍有待明確。

圖3:CF患者痰樣本13主要菌屬的聚類分析。每個臨床狀態(tài)被注明 (B：基線臨床狀態(tài); E：肺加重; T：治療發(fā)作期; R：恢復(fù)期; MD：數(shù)據(jù)缺失；每一個菌屬的相對豐度用紅色（高豐度）或者黃色、亮白色（低豐度）標(biāo)注。

微生物結(jié)構(gòu)與銅綠假單胞菌感染狀態(tài)相關(guān)

接著通過比較“never”組(在痰或咳嗽拭子中從沒有檢測到銅綠假單胞菌定植)和“free”組(至少在前一年沒有銅綠假單胞菌定植) CF病人菌群來判斷銅綠假單胞菌是否影響呼吸道菌群結(jié)構(gòu)。首先發(fā)現(xiàn)兩組病人間細(xì)菌密度和銅綠假單胞菌reads數(shù)目沒有差異，接著發(fā)現(xiàn)這兩組CF病人間的菌群多樣性指數(shù)（Shannon）和菌群均勻度也沒有差異，然而菌群豐度在兩組CF病人間存在差異：“never”組病人的菌群豐度[Chao-1: 79.8 (72.03–87.61); 實際觀察到的菌種數(shù)目: 71.6 (63.85–79.43)]要比“free”組病人[Chao-1: 62.7 (52–73.5); 實際觀察到菌種數(shù)目:55.9 (45.24–66.71)]的菌群豐度更高，因此CF病人呼吸道菌群豐度直接受銅綠假單胞菌首次植入的負(fù)調(diào)控。另外，如圖2B和圖S3所示，CF病人呼吸道菌群結(jié)構(gòu)受銅綠假單胞菌不同感染狀態(tài)的影響。

圖2B：“never”組(紅色圓圈)和“free”組(藍(lán)色方塊)CF病人菌群結(jié)構(gòu)PCoA分析。

圖S3：CF病人肺部微生物組屬水平上的分類柱狀圖。

結(jié)果總結(jié)：

l  CF病人的呼吸道微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很高的多樣性，并且這與CF病人的較小年齡相關(guān)。

l  鑒定到一個核心CF肺部菌群，它是由來自于5個門的13個主要菌屬構(gòu)成的，其中大多數(shù)是專性厭氧菌。

l  個體間和個體內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)有明顯的變化。

l  CF病人呼吸道菌群豐度直接受銅綠假單胞菌首次植入的負(fù)調(diào)控。

l  無論銅綠假單胞菌感染狀態(tài)如何一類厭氧菌群都持續(xù)存在，這表明它們在CF患者肺部的感染病理生理學(xué)中發(fā)揮著重要作用，因此某些菌屬可能是肺部感染時期的潛在生物標(biāo)志物。