天昊生物客戶在《Applications in Plant Sciences》上發(fā)表中國(guó)特有針葉樹華山松的微衛(wèi)星標(biāo)記特征解析

發(fā)稿時(shí)間：2016-11-17來源：天昊生物

       西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中國(guó)西部資源生物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李忠虎教授課題組近期在《Applications in Plant Sciences》上發(fā)表了中國(guó)特有針葉樹華山松的微衛(wèi)星標(biāo)記特征解析的研究成果。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的基因組測(cè)序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Characterization of Polymorphic Microsatellite Markers in Pinus armandii

(Pinaceae), an Endemic Conifer Species to China

中文題目：中國(guó)特有針葉樹華山松的微衛(wèi)星標(biāo)記特征解析

研究背景:

華山松是一種常綠針葉樹種，是中國(guó)中部和西南部特有的樹種，以往對(duì)華山松的研究主要集中在其生理生態(tài)學(xué)，近年來，由于亂砍濫伐和自然棲息地破壞，華山松自然種群已顯著降低，因此了解其種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性對(duì)制定有效的保護(hù)和管理措施是十分必要的。在這項(xiàng)研究中，我們對(duì)華山松及其近源物種的SSR多態(tài)性進(jìn)行了闡述從而有助于它們下一步的群體遺傳學(xué)研究。

研究結(jié)果：

1.    從新鮮針葉中提取基因組DNA，使用Illumina MiSeq PE300，得到6,783,777個(gè)clean reads，使用CLC Genomics Workbench version 7.5組裝得到350,628個(gè)contigs，使用SciRoKo version 3.1提取了含有SSR的contigs，從這些contigs中找到887個(gè)SSR候選位點(diǎn)，然后針對(duì)這些候選SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)引物的標(biāo)準(zhǔn)是：（1）大小在100-350bp；（2）引物大小18-25 bp，最佳大小為20 bp；（3）引物熔解溫度從55°C-63°C，最佳熔解溫度為60°C；（4）GC含量為40%-60%。

2.    隨機(jī)挑選50對(duì)SSR引物在3個(gè)華山松自然群體的52個(gè)個(gè)體中測(cè)試其擴(kuò)增效率和多態(tài)性。使用GenAlEx version 6.501來評(píng)價(jià)微衛(wèi)星位點(diǎn)的各種群體遺傳參數(shù)，包括每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)，預(yù)期和觀測(cè)到的雜合度（He和Ho）和Hardy-Weinberg(HWE)，使用GENE-POP version 4.2.2來計(jì)算LD值， 并且使用MICRO-CHECKER version 2.2.3計(jì)算了無效等位基因頻率。

3.    50對(duì)SSR引物中共有34對(duì)引物成功擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，其中18個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出多態(tài)性（表1）。這些多態(tài)性引物的等位基因數(shù)范圍是2-5，平均2.4。

表1：34個(gè)SSR引物在華山松中的分型結(jié)果

4.    預(yù)期雜合度（He）范圍是0.061～0.609，平均0.384；觀測(cè)到的雜合度（Ho）范圍是0.063-0.947，平均0.436（表2）。兩對(duì)引物（pa3553和pa118137）HWE被發(fā)現(xiàn)大大偏離。這種偏差可能是樣本量不足，個(gè)體之間的非隨機(jī)交配，遷移，或自然選擇這兩個(gè)位點(diǎn)造成的。

表2：3個(gè)華山松自然群體的遺傳多樣性

5.   為了使開發(fā)的這些SSR位點(diǎn)得到更廣泛的應(yīng)用，本文檢測(cè)了這18對(duì)引物在其它5種與華山松較同源的松樹中（紅松、喬松、西伯利亞紅松、偃松、白皮松）的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這18對(duì)引物中有17對(duì)引物能在這5種松樹中擴(kuò)增出明顯條帶，而引物pa3553在偃松和白皮松中則不能擴(kuò)增出條帶（表3）。

表3：在華山松中呈現(xiàn)多態(tài)性的18個(gè)SSR引物在其它5種松樹中的分型結(jié)果

亮點(diǎn)：

本文利用華山松基因組測(cè)序數(shù)據(jù)采用de novo的方法拼接了一部分基因組contig，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了887候選SSR多態(tài)位點(diǎn)，再對(duì)其中一些候選SSR位點(diǎn)擴(kuò)大樣本驗(yàn)證其多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18個(gè)SSR位點(diǎn)在華山松中確實(shí)具有多態(tài)性，然后在其它5種松樹發(fā)現(xiàn)17種SSR位點(diǎn)也具有多態(tài)性，從而找到了適合松樹遺傳多樣性研究的SSR位點(diǎn)。實(shí)際上華山松基因組測(cè)序數(shù)據(jù)除了挖掘基因組上的SSR位點(diǎn)，還可以將測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組（近源物種）序列進(jìn)行比對(duì)，去除核基因組序列 ，對(duì)其葉綠體基因組進(jìn)行組裝拼接，從而得到其細(xì)胞器基因組序列。