天昊生物客戶在《Frontiers in Microbiology》上發(fā)表不同施肥制度對叢枝菌根真菌（AMF）群落組成影響的文章

發(fā)稿時間：2016-12-12來源：天昊生物

      南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院凌寧教授課題組近期在《Frontiers in Microbiology》上發(fā)表了施肥制度對叢枝菌根真菌（AMF）群落組成的影響與玉米根際土壤中的有機質組成相關的文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的擴增子測序工作和生物信息學分析。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Impacts of Fertilization Regimes onArbuscularMycorrhizal Fungal (AMF)Community Composition WereCorrelated with Organic MatterComposition in Maize RhizosphereSoil

中文題目：施肥制度對叢枝菌根真菌（AMF）群落組成的影響與玉米根際土壤中的有機質組成相關

期刊名：Frontiers in Microbiology發(fā)表時間： 2016年11月影響因子：4.165

技術：18S rRNA擴增子測序，AMV4.5NF–00引物

測序平臺：IlluminaMiSeq測序平臺

實驗描述

田間施肥試驗于2013年在黑龍江省農科院的現(xiàn)代農業(yè)科技示范站實施。這個地區(qū)有典型的季風氣候，年平均3.6^?C和486.4–543.6毫米降雨量。種植制度主要是一年一次玉米作物。有四個實驗處理：（1）NK，只施加氮和鉀肥；（2）NPK，只施加N、P、K肥；（3）NPKM，施加N、P、K和有機肥；（4）M，只施加有機肥。每一個處理在不同的3個地塊有三個生物學重復。

根際土壤采樣與DNA提取

于2014年10月從各處理收集根際土壤樣品，從每一個地塊隨機收集五個玉米植株的根際土壤樣品組成混合樣品。根被大力地震動從而分離那些不是緊緊地吸附于根上的土壤，然后，5克含有牢牢吸附土壤的植物根際溶于30毫升蒸餾水，并高速渦旋1分鐘。蒸餾水中的土壤作為根際土壤用于后續(xù)分析。真空冷凍干燥后，一部分被保存在4^?C 用于GC–MS分析，而另一部分被存儲在?80^?C用于DNA提取。每個肥料處理的3個生物學重復根際樣品用于DNA提取。使用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mo Bio)提取0.25克凍干土壤的總DNA。

根際土壤溶解有機物提取和GC–MS分析

乙酸乙酯提取的溶解有機物（DOM）用于GC–MS分析。由于土壤溶解有機物DOM的高多樣性，乙酸乙酯提取的溶解有機物（DOM）不包含所有復雜的土壤有機質，但它能全面闡述溶解有機物（DOM）中的所有可能的分子類別。每個土壤樣品（0.5克）和5毫升乙酸乙酯添加到離心管。30?C 170轉搖1小時，該懸浮液被過濾（0.45毫米）到一個干凈的離心管，35?C真空濃縮至0.5毫升，濃縮樣品被存儲用于GC–MS分析。

研究背景:肥料應用的增加提出了一個問題：富營養(yǎng)化的土壤對土壤微生物群落產生什么影響。一些研究表明，平衡施肥，包括補充氮（N），磷（P）和鉀（K），改變了土壤微生物群落和增強了土壤微生物的有效代謝因為可利用營養(yǎng)的增加，在多數(shù)情況下，這會導致土壤生產力的提高，但是過量和不適當?shù)幕适┯脮斐闪艘幌盗协h(huán)境問題和土壤退化。與化學施肥相比，對農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)施加有機肥料常被用來增加土壤有機質（SOM）的含量，用來改變了土壤物理、化學和生物性質，因此提高了作物產量。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，因非常有必要了解有機或無機肥施用對土壤微生物群落的影響。例如，土壤真菌多樣性被認為是一個很好的和靈敏的土壤肥力指標。叢枝菌根真菌（AMF）是一類重要的土壤微生物群，它能調節(jié)農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的多種功能。

叢枝菌根真菌是古老的根共生生物，它們的第一次出現(xiàn)與陸生植物的出現(xiàn)相吻合。叢枝菌根真菌（AMF）與80%的陸生植物物種的根形成共生體系，叢枝菌根真菌從植物體內獲取必要的碳水化合物及其他營養(yǎng)物質，而植物也從真菌那里得到所需的營養(yǎng)及水分等，因此AMF在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵作用，土壤對某些營養(yǎng)素的需求可通過AMF群落組成或多樣性的變化反映出來，然而，人類活動如何驅動AMF群落變化仍然是未知的。所有AMF都屬于球囊菌門，而且大多數(shù)是專性共生，是不能單獨培養(yǎng)的。因此AMF類群的鑒定不能依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。在這項研究中，我們使用擴增子測序調查不同施肥制度對玉米根際土壤AMF群落組成和多樣性的影響。

研究結果：

數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過對數(shù)據(jù)進行處理和優(yōu)化，得到1214071條有效序列，占主導地位的長度分布為大約221-240 bp。通過和SILVA數(shù)據(jù)庫比對，得到了很多非球囊菌門得序列，總體而言，使用引物對AMV4.5NF/AMDGR只得到了165805條球囊菌門序列（占總數(shù)的13.5%），其它主要真菌類別是壺菌門、Basidiomycota,、Zygomycota,、Ascomycota、Blastocladiomycota（表1）。

表1 使用引物對AMV4.5NF/AMDGR只得到土壤樣品中的每個真菌門序列的比例分布

施肥對AMF群落a多樣性的影響

與其它處理相比，施加有機肥（M）能顯著增加AMF群落OTUs的數(shù)量（圖S1）。計算了每個樣本的Shannon 指數(shù)和ACE指數(shù)（圖1）。施加有機肥（M）土壤中的ACE指數(shù)顯著較高。

圖S1  樣品的稀釋性曲線

圖1 不同處理樣品的Shannon 指數(shù)和ACE指數(shù)

施肥對AMF群落組成的影響

在不同處理中，AMF群落組成變化很明顯。第一主成分能解釋AMF群落變化的62.22%，能把是否施加有機肥的群落明顯分開（圖2）。Adonis分析結果表明，不施加有機肥（?M）的組別，包括NK和NPK，與有機肥處理（+M）組別，包括NPKM和M，在群落水平上有顯著差異(R²=0.41559, P = 0.003)（表S1），因此，我們把4個處理分為兩組（?M和+M）用于隨后的分析。

圖2 不同處理AMF菌落的RDA分析

表S1不施加有機肥（?M）與施加有機肥（+M）組別的AMF菌落結構差異

同時，施用有機肥是帶來玉米根際AMF群落組成變化的第一關鍵因素（R²= 0.7695，P= 0.002）（表S2），第二大影響因素是N肥（R²=0.6472、D P 0.022），其次是磷肥（R²=0.5048，P =0.04）。

表S2AMF菌落結構RDA的蒙特卡洛置換檢驗

乙酸乙酯提取的溶解有機物（DOM）和AMF群落組成之間的關系

Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)根際土壤的乙酸乙酯提取溶解有機物與AMF群落顯著相關。GC–MS共鑒定了59個有機化合物，其中11個有機化合物被確定與AMF群落相關，11個相關分子中大部分是長鏈烷烴和苯。同時硬脂酸和3-(2, 6, 6-trimethyl-1-cyclohexene-1-yl) allylalcohol在NPKM處理土壤中沒有被檢測到，而1、4-dimethylnaphthalene只是在NK處理土壤中被檢測到，然而，2-ethylnaphthalene在NK處理土壤中沒有被檢測到。此外，十八烷和二十六烷在有機肥處理組別(M、NPKM) 都沒有檢測到，但是在無機肥處理組別 (NK、NPK)（M、NPKM）都檢測到了，這表明不同類別肥料處理通過改變有機成分推動了AMF群落的變化。

乙酸乙酯提取溶解有機物與AMF群落屬的皮爾森相關性分析表明兩類有機化合物與 球囊霉屬負相關，而一類有機化合物與Rhizophagus正相關（圖4）。

圖4 乙酸乙酯提取溶解有機物與AMF群落屬的皮爾森相關性分析

有機肥料處理和無機肥料處理的AMF群落網絡圖差異

基于上述結果，我們把4個土壤處理劃分為兩個處理(+M和-M)。因此，我們用這兩個處理用于網絡分析。如圖5所示，有機肥料處理(NPKM、M)和無機肥料處理(NK、NPK)的網絡分析結果是有顯著差異的。在無機肥料處理 (?M)中，網絡有36個節(jié)點和80個邊緣，4個群落的模塊化為0.540。在有機肥料處理 (+M)中，網絡有35個節(jié)點和86個邊緣，5個群落的模塊化為0.438（圖5）。我們定義有七個以上邊緣的節(jié)點為網絡中心，有機肥料處理 (+M)網絡中心的數(shù)量多于無機肥料處理 (?M)，這表明有機肥料處理 (+M)有更多活躍的物種在AMF群落中與其他物種存在相互作用。所有的網絡中心都被歸類為球囊霉目。同時，兩個網絡共享3個網絡中心，包括OTU9，OTU31和OTU217。這個三類OTUs屬于進化樹的不同分支（圖6），OTU9和OTU 217屬于球囊霉屬，而OTU31屬于近明球囊霉。

圖5無機肥料處理 (?M)和有機肥料處理 (+M)AMF群落的網絡圖分析

圖6 兩個網絡圖分析得到的所有OTUs序列的進化樹分析

總結：

?  在玉米根際AMF真菌多樣性被不同施肥制度顯著改變。

?  施用有機肥是帶來玉米根際AMF群落組成變化的第一關鍵因素，第二大影響因素是N肥，其次是磷肥。

?  GC–MS測定發(fā)現(xiàn)施加有機肥能顯著改變玉米根際的有機質組成，皮爾森相關性分析表明兩類有機化合物與球囊霉屬負相關，而一類有機化合物與Rhizophagus正相關。

?  有機肥料處理和無機肥料處理的AMF群落網絡分析結果是有顯著差異的，有機肥料處理網絡中心的數(shù)量多于無機肥料處理。兩個網絡共享3個網絡中心，這三類OTUs都被歸類為球囊霉目。

?  綜上所述，不同施肥模式對AMF群落的影響于玉米根際土壤中有機質組成相關，而施用有機肥能激活更多的AMF物種與其他玉米根際的物種相互作用。這為調節(jié)植物和真菌的共生系統(tǒng)，維護作物的高產量和健康生長，并為合理施肥提供了初步依據(jù)。

關于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴增，保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內誤差；數(shù)據(jù)質量高，有效序列Q30達到80%以上；加上最新升級的分析內容和解釋詳盡的結題報告，帶您享受極致的微生物擴增子測序體驗。