天昊生物推出Illumina 850k甲基化芯片檢測服務

發(fā)稿時間：2017-06-19來源：天昊生物

Illumina 850k (EPIC)甲基化芯片技術介紹

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技術簡介：

DNA甲基化在調(diào)控基因表達過程中起著非常重要的，它能使細胞處于一個特殊狀態(tài)，抑制病毒和非寄主元件的表達，促進對環(huán)境刺激的反應。異常的DNA甲基化（高或低）及對基因表達的影響已經(jīng)參與到許多疾病過程中，包括癌癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，老化和發(fā)育。

為了更經(jīng)濟有效地進行DNA甲基化分析，Illumina公司提供了一個強大的甲基化分析平臺： Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip （DNA甲基化850K芯片），不但包含了原450K芯片90%以上的位點，并額外增加了增強子區(qū)的350,000個位點，可以對正常樣本和FFPE樣本單個CpG位點進行定量甲基化檢測，該芯片是以其全基因組覆蓋度和精準度，目前成為表觀基因組關聯(lián)研究（EWAS）的最理想解決方案。

 

技術優(yōu)勢

 

全基因組覆蓋：

每個樣本檢測853,307個CpG位點，全面覆蓋CpG島、啟動子、編碼區(qū)及增強子。覆蓋CpG島、RefSeq基因、ENCODE開放染色質(zhì)、ENCODE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、FANTOM5增強子區(qū)域。850K芯片包含以下位點：

l   CpG島以外的CpG位點；

l   人類干細胞中鑒定到的非CpG甲基化位點（CHH位點）；

l   在正常樣本VS腫瘤樣本（多種類型腫瘤）以及不同類型組織中鑒定到的差異甲基化位點；

l   FANTOM5項目鑒定到的增強子區(qū)域；

l   ENCODE項目開放染色質(zhì)和增強子區(qū)域；

l   DNase超敏位點；

l   miRNA啟動子區(qū)域；

l   原450K芯片＞90%的位點；

 

圖2  EPIC 甲基化芯片提供了基因區(qū)域廣泛高密度的覆蓋。

 

簡化的工作流程：

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片提供一個精簡的工作流程，不需要PCR，樣本量要求低（最低只需要250ng DNA）。

 

高質(zhì)量的數(shù)據(jù)：

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片采用Infinium I和 Infinium II技術（圖4），從而提高了甲基化分析的覆蓋深度。Infinium II技術采用單一磁珠類型的變性寡核苷酸探針，即使序列中有多達三個甲基化或非甲基化的CpG位點，也不會對待測位點結(jié)果造成影響。

圖4  EPIC 甲基化芯片采用Infinium I和 Infinium II技術從而提高了覆蓋度。Infinium I技術針對每個CpG位點設計了兩種磁珠類型：M型磁珠（M型磁珠尾部為G，用來檢測甲基化位點）和U型磁珠（U型磁珠尾部為A，用來檢測未甲基化位點），每種磁珠類型分別針對甲基化或非甲基化兩種狀態(tài)，通過檢測M型磁珠與U型磁珠熒光信號來計算位點的甲基化程度。Infinium II技術只設計一種磁珠類型（尾部為C，從而與待測位點的前一個堿基配對）：與不同甲基化狀態(tài)（非甲基化或甲基化位點）的單堿基雜交，根據(jù)兩種不同熒光信號計算位點的甲基化程度。

 

精密度和準確度:

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片在不同重復間顯示出很強的相關性（R² >0.98），與Infinium Human Methylation 450K芯片也有很強的重復性（R² >0.98）（圖6A、6B），與全基因組甲基化測序也有很強的重復性（圖6C）。

圖6  Infinium技術具有較高的重復性和測序數(shù)據(jù)較高的相關性。 A. 在非腫瘤組織不同重復間顯示出很強的相關性（R² >0.98）。B. 850K芯片和450K芯片之間也有很強的重復性（R² >0.98）。C. 在正常組織和腫瘤肺組織相比于全基因組測序數(shù)據(jù)有很強的相關性。

 

分析靈敏度：

通過比較實驗重復的結(jié)果（8個生物學重復樣品），已經(jīng)證明Infinium Methylation EPIC甲基化芯片可靠地檢測0.2的delta-beta值，低于1%的假陽性率。

 

內(nèi)部質(zhì)量控制：

Infinium HD檢測產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，具有樣本依賴和樣品不依賴的對照，例如Infinium Methylation EPIC甲基化芯片配有專為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后序列復雜度降低而設計的負對照。

 

高應用兼容性：

Infinium產(chǎn)生的甲基化數(shù)據(jù)很容易與Illumina公司其它平臺產(chǎn)生的數(shù)據(jù)兼容，例如基因表達譜分析，這使得研究人員能夠?qū)虮磉_數(shù)據(jù)和Infinium甲基化數(shù)據(jù)進行整合分析。

 

適用于FFPE樣品的甲基化研究：

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片改進版的protocol適用于FFPE樣本的甲基化研究，利用Infinium FFPE DNA修復方案可以獲得可靠可重復的結(jié)果（表2）。

表1. Infinium Methylation EPIC甲基化芯片檢測正常樣本和FFPE樣本時的數(shù)據(jù)對比。 與正常樣本相比，F(xiàn)FPE樣本的位點檢出率大于90%，不同重復間顯示出很強的相關性（R² 大于0.98）。

 

技術參數(shù)與實驗流程

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技術參數(shù)

樣本要求	檢測策略	其它說明
·             樣品類型：基因組DNA ·             樣品需求量：總量>2μg；濃度≥50ng/μL ·             樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間 ·             樣品運輸：DNA低溫運輸（-20℃） ·             樣本無明顯降解，無污染	·             芯片雜交	·             可檢測FFPE樣本 ·             使用Infinium技術，無其它甲基化DNA捕獲方法常有的偏向性

 

實驗與數(shù)據(jù)分析流程

A.         實驗流程

B.          數(shù)據(jù)分析流程

 

甲基化芯片完成以后做點什么呢？

l  全基因組850K芯片篩選；

l  通過β值篩選甲基化差異顯著位點；

l  篩選甲基化差異區(qū)域（DMR）；

l  綜合生物學意義和差異甲基化區(qū)域，選擇目的區(qū)域和目的基因；

l  利用MethylTarget技術在大樣本中檢測這些顯著差異位點的甲基化水平；

 

天昊生物在提供全基因組甲基化芯片服務的同時，還提供候選基因甲基化水平的定量或定性檢測。我們根據(jù)客戶提供的候選基因（來自文獻、甲基化芯片、表達譜芯片或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)），針對其啟動子/CpG島/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域等區(qū)域進行甲基化檢測。

l  通過文獻、甲基化芯片或表達譜芯片或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的方法篩選目的基因；

l  通過計算機軟件尋找候選基因的CpG區(qū)域；

l  利用MethylTarget技術對候選CpG位點進行定量檢測；

 

關于天昊：

天昊生物秉承"創(chuàng)新基因科技，成就科學夢想"的核心理念，目前形成了全基因甲基化測序/全基因組850K甲基化芯片檢測/目的區(qū)域富集甲基化檢測/DNA甲基化克隆測序全面的整體解決方案，目前天昊生物通過自主創(chuàng)新，獨立研發(fā)了高通量高靈敏度目的區(qū)域富集甲基化水平檢測技術MethylTarget^TM，目前天昊生物在甲基化定量檢測領域處于絕對領先位置，天昊生物希望憑借自身積累的豐富經(jīng)驗，為廣大客戶提供最好最優(yōu)質(zhì)的甲基化檢測服務。