[昊閱讀] 腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致高血壓的發(fā)生

發(fā)稿時(shí)間：2017-10-19來(lái)源：天昊生物

副標(biāo)題：四管齊下：宏基因組+代謝組+糞菌移植+擴(kuò)增子測(cè)序！

 

英文題目：Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension

中文題目：腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致高血壓的發(fā)生

期刊名：Microbiome       發(fā)表時(shí)間： 2017           影響因子： 8.496

發(fā)表單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院高血壓中心

技術(shù)：

l 宏基因組測(cè)序(GM) ：41名對(duì)照者（Control）、56例高血壓前期患者(pHTN)、99例原發(fā)性高血壓患者(HTN)的糞便樣本

l 代謝組（LC/MS）：30名對(duì)照者（Control）、31例高血壓前期患者(pHTN)、63例原發(fā)性高血壓患者(HTN)的空腹全血樣本

l 糞便移植無(wú)菌小鼠: 對(duì)照組小鼠n=5、HTN組小鼠n=10

l 受體小鼠糞便16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序（V4）

篩選標(biāo)準(zhǔn)：所有高血壓患者都是最新診斷的高血壓患者，并且都沒(méi)進(jìn)行過(guò)降壓治療。有癌癥、心力衰竭、腎衰竭、吸煙、中風(fēng)、外周動(dòng)脈疾病和慢性炎癥性疾病的患者被排除。不能使用以下藥物，包括他汀類藥物、阿司匹林、胰島素、二甲雙胍、硝苯地平和美托洛爾。過(guò)去8周內(nèi)不能接受抗生素或益生菌治療。除了收縮壓和舒張壓外，其它臨床參數(shù)在患者和對(duì)照者之間均無(wú)顯著性差異（除了空腹血糖水平有差異）。

研究背景： 

最近，腸道微生物在代謝性疾病中的作用已經(jīng)顯露出來(lái)，尤其是在心血管疾病。高血壓是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的心血管疾病之一，然而腸道菌群失調(diào)是否參與高血壓的發(fā)生發(fā)展仍然是未知的。為了探討這個(gè)問(wèn)題，本文對(duì)健康對(duì)照者、高血壓前期患者、原發(fā)性高血壓患者進(jìn)行了全面的宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析，并將高血壓患者糞便菌群移植到無(wú)菌小鼠，觀察其是否出現(xiàn)高血壓癥狀。

研究結(jié)果：

1、 微生物多樣性和腸型分析

稀釋性曲線結(jié)果表明所測(cè)數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)基因。對(duì)照組新基因速率超過(guò)疾病組新基因獲取速率，提示高血壓前期患者(pHTN)和原發(fā)性高血壓患者(HTN)的基因豐富相對(duì)較低（圖1A）。與對(duì)照組相比，PHTN和HTN組的基因數(shù)量顯著性減少（圖1B）。在屬水平PHTN和HTN組的腸道菌群a多樣性顯著降低（圖1C）。這些結(jié)果表明高血壓患者腸道菌群減少。

196個(gè)樣本分可以為兩個(gè)不同的腸型（圖1D）：腸型1（Prevotella）和腸型2（Bacteroides）. PHTN和HTN組具有更多比例的Prevotella腸型，而健康對(duì)照組具有更多比例的Bacteroides腸型（圖1F）。

 

圖1. 高血壓患者微生物多樣性降低，腸型發(fā)生轉(zhuǎn)化

2、 與高血壓相關(guān)的菌屬

44個(gè)菌屬在組間存在差異（圖2A）。Prevotella和Klebsiella菌在PHTN和HTN組中顯著增加（圖2B）。Prevotella起源于口腔和生殖道，牙周病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與Prevotella相關(guān)。許多傳染病認(rèn)為是Klebsiella造成的。相比之下，Faecalibacterium, Oscillibacter, Roseburia,Bifidobacterium, Coprococcus, Butyrivibrio在健康人群富集（圖2B）。Faecalibacterium（柔嫩梭菌）和Roseburia（羅斯氏菌）豐度下降已知與克隆氏氏病和潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生相關(guān)，這兩種細(xì)菌都是丁酸生產(chǎn)的關(guān)鍵菌。這表明Prevotella和Klebsiella菌的過(guò)度生長(zhǎng)可能在高血壓的病理中起重要作用。同時(shí)需要注意的是，高血壓前期組（PHTN）已經(jīng)具有與高血壓組（HTN）類似的微生物群落。這表明腸道菌群變化可能早于高血壓的形成。

 

圖2. 各組間的差異菌屬分析

3、 PHTN和HTN組中顯著富集的CAG

與對(duì)照相比，分別有316和372個(gè)CAG在PHTN和HTN組得到富集。對(duì)照組中顯著富集的CAG主要來(lái)自Firmicutes和Roseburia（圖3A，B）；PHTN組富集的CAG主要來(lái)自Enterobacter（腸桿菌，一種與肥胖有關(guān)的致病細(xì)菌）；隸屬于Fusobacterium和Klebsiella的CAG在PHTN和HTN組得到富集。

 

圖3. 與對(duì)照相比，上調(diào)或下調(diào)菌類型的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析。CAG為至少包含50個(gè)連鎖基因的基因簇。節(jié)點(diǎn)的大小表示該CAG的基因數(shù)量。節(jié)點(diǎn)的顏色代表了它們所屬分類。斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)值大于0.8用紅色線段連接，0.7-0.8用灰色線段連接。

4、 臨床指標(biāo)與CAG細(xì)菌相關(guān)性分析

將臨床指標(biāo)包括收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、體重指數(shù)（BMI）、空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）與CAG進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SBP和DBP可以負(fù)調(diào)控對(duì)照組富集的CAG（例如Firmicutes、Roseburia），可以正調(diào)控pHTN和HTN組富集的Prevotella和Desulfovibrio。而TC和TG與pHTN和HTN組富集的Enterobacter呈負(fù)相關(guān)（圖S6）。這些結(jié)果表明PHTN和HTN組的細(xì)菌群落很相似，這些細(xì)菌的集體效應(yīng)可能與
高血壓患者的腸道微生態(tài)失調(diào)相關(guān)。表明PHTN和HTN組的細(xì)菌群落很相似，這些細(xì)菌的集體效應(yīng)可能與高血壓患者的腸道微生態(tài)失調(diào)相關(guān)。

 

圖S6. 臨床指標(biāo)與CAG豐度相關(guān)性分析。正相關(guān)用紅色表示，負(fù)相關(guān)用藍(lán)色表示，+: p值＜0.01；*: p值＜0.05。

5、 PHTN和HTN組菌群功能的改變

健康組和高血壓組在腸道菌群基因功能上具有明顯差異（圖4A）。無(wú)論是KEGG modules（圖4B）還是碳水化合物活性酶類（圖4C），與對(duì)照組相比，PHTN和HTN組都有類似的差異，說(shuō)明PHTN和HTN組腸道菌群功能很類似。39個(gè)KEGG modules在PHTN和HTN組減少，主要包括：支鏈氨基酸的合成運(yùn)輸、酮體生物合成、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、甲硫氨酸和嘌呤降解（圖4B），這些代謝功能對(duì)宿主是必不可少的。17個(gè)KEGG modules在PHTN和HTN組升高，主要包括：LPS合成運(yùn)輸、磷脂運(yùn)輸、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）、

苯丙氨酸和磷脂酰乙醇胺合成、分泌系統(tǒng)（圖4B）。PHTN和HTN組的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)基因顯著富集但是glycan-utilizing enzymes相關(guān)基因顯著減少（圖4C）。

 

圖4  PHTN和HTN組微生物基因功能注釋。 A.196個(gè)樣品KEGG Orthology相對(duì)豐度比較。 B.各組間腸道微生物KEGG modules的差異比較。C. 各組間腸道微生物CAZy家族豐度的差異比較。

6、 各組間腸道菌群代謝物比較分析

因?yàn)槟c道菌群的代謝產(chǎn)物可以進(jìn)入血液并可以影響宿主的生理機(jī)能，利用LC/MS對(duì)124個(gè)樣本的血清進(jìn)行代謝物分析，進(jìn)而對(duì)腸道菌群和代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析。PLS-DA分析能把代謝物在健康組、PHTN和HTN組明顯分開(kāi)（圖5A、B），其中PHTN和HTN組的腸道菌群代謝產(chǎn)物非常類似。對(duì)照組和PHTN共有167個(gè)代謝物有差異，對(duì)照組和HTN組共有215個(gè)代謝物有差異（圖5C）。值得注意的是，PHTN和HTN組的代謝產(chǎn)物變化非常類似，這與前面的腸道菌群變化緊密相關(guān)（圖5D）。3,4,5-三甲氧基肉桂酸、溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）、S-羧甲基-L-半胱氨酸和溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）在PHTN和HTN組明顯減少。N-乙酰- L -精氨酸α、硬脂酸、磷脂酸（PA）和葡萄糖苷在在PHTN和HTN組明顯增多。微生物菌群與代謝產(chǎn)物有相關(guān)性：對(duì)照組富集的三氯葡萄糖醛酸與Bifidobacterium、Akkermansia正相關(guān)，但是與Prevotella呈負(fù)相關(guān)。HTN組富集的Klebsiella、Prevotella、 Enterbacter與硬脂酸呈正相關(guān)，而硬脂酸與Bifidobacterium、Roseburia呈負(fù)相關(guān)。

 

圖5  PHTN和HTN組的異常代謝模式。 A.不同組別血清代謝譜的PLS-DA分析。 B. 不同組別血清代謝譜的散點(diǎn)圖分析。 C. 在PHTN和HTN組發(fā)生明顯變化的代謝物。ES +：離子模式，ES?：負(fù)離子模式。D.不同組別血清代謝產(chǎn)物的差異比較。E. 26種內(nèi)源性代謝物與44個(gè)菌屬的Spearman相關(guān)性分析。對(duì)照組：綠色，高血壓組：粉紅色。

7、 建立識(shí)別高血壓病人的的診斷模型

建立了基于CAG和代謝物的高血壓疾病診斷模型，此診斷模型可以準(zhǔn)確區(qū)分高血壓患者和健康人，AUC值分別為0.91，表明此模型很準(zhǔn)確（圖6A），另外此診斷模型也可以準(zhǔn)確區(qū)分高血壓前期患者和健康人，AUC值分別為0.89（圖6B）。此模型不能有效區(qū)分PHTN和HTN組（圖6C）。PHTN和HTN組區(qū)別與對(duì)照組的一些CAG是共同的：例如CAG-172 (Prevotella), CAG-197(Prevotella), CAG-759 （Faecalibacterium), CAG-765(Faecalibacterium), and CAG-793 (Faecalibacterium) （圖6D、E）

 

圖6  建立了從對(duì)照組準(zhǔn)確區(qū)分高血壓前期和高血壓患者的疾病分類器

8、 糞便移植可以導(dǎo)致血壓升高

在這項(xiàng)研究中，似乎高血壓的主要原因是腸道微生態(tài)失調(diào)，因此，本文想研究是否可以通過(guò)微生物移植來(lái)改變血壓。因此把高血壓患者的糞便移植到無(wú)菌小鼠體內(nèi)，來(lái)看看這些無(wú)菌小鼠的反應(yīng)。本研究的微生物移植供體包括兩例高血壓患者和正常血壓對(duì)照者。8～10周的小鼠分為兩組(對(duì)照組n=5, HTN組n=10 )，分別口服接種供體糞便樣本（圖7A）。喂養(yǎng)7天后使用通過(guò)16S擴(kuò)增子測(cè)序研究受體小鼠的糞便樣品。從高血壓患者成功定植到無(wú)菌小鼠128個(gè)菌屬。從健康對(duì)照者成功定植到無(wú)菌小鼠110個(gè)菌屬（圖7B）。香濃指數(shù)表明HTN組小鼠細(xì)菌多樣性少（圖7C）。PCoA分析表明高血壓患者和對(duì)應(yīng)受體小鼠菌群結(jié)構(gòu)類似，而對(duì)照健康人和對(duì)應(yīng)受體小鼠的菌群結(jié)構(gòu)類似（圖7D）。屬水平上，Anaerotruncus, Coprococcus, Ruminococcus, Clostridium, Roseburia, Blautia, Bifidobasterium在HTN組小鼠較少（圖7E），而Coprobacillus和Prevotella則在HTN組小鼠富集，這與前面的人宏基因組分析結(jié)果一致。移植后10周，與對(duì)照組相比，移植了HTN糞便的小鼠表現(xiàn)出顯著較高的收縮壓（SBP），舒張壓（DBP）和平均血壓（MBP）（圖7F）。

 

圖7糞便移植后的受體小鼠腸道微生物分布及血壓統(tǒng)計(jì)。

總結(jié)：

l 與健康對(duì)照者相比，PHTN和HTN組的微生物豐富度和多樣性顯著下降。

l PHTN和HTN組具有更多比例的Prevotella腸型。

l PHTN和HTN組中有益菌明顯降低、Prevotella和Klebsiella等有害菌過(guò)度生長(zhǎng)。

l PHTN和HTN組中與疾病相關(guān)的微生物功能和基因顯著富集。

l PHTN和HTN組的微生物和代謝產(chǎn)物變化非常相似，表明PHTN和HTN組的代謝產(chǎn)物改變與微生物組的改變密切相關(guān)。

l 建立了基于菌群和代謝物的疾病診斷模型，能準(zhǔn)確區(qū)分對(duì)照組和高血壓前期、高血壓患者。

l 將高血壓患者糞便移植到無(wú)菌小鼠，結(jié)果無(wú)菌小鼠血壓升高。