Microbiome：綿羊上呼吸道和下呼吸道微生物比較分析

發(fā)稿時間：2017-11-21來源：天昊生物

英文題目： Comparing microbiotas in the upper aerodigestive and lower respiratory tracts of lambs

中文題目：綿羊肺部微生物

期刊名：Microbiome           

發(fā)表時間： 2017.10.27     

發(fā)表單位：英國愛丁堡大學(xué)羅斯林研究院和皇家（迪克）獸醫(yī)研究學(xué)院

研究背景

最近，在人類和動物模型中研究了肺微生物在健康和疾病中的重要性。在人類中，最近已證實，肺部微生物是由口腔微生物而來的，因此本研究想確定綿羊是否相同。                             

研究對象

40只羊羔（20只雄性和20只雌性）的肺液和上呼吸消化道（口咽）的拭子樣本：平均年齡：48.8 天 ± 0.8，平均體重: 20.6公斤±2.6。在安樂死之前，唯一的食物來源母羊的乳汁和牧草。

樣本取樣

1）口咽取樣：羊羔被實施安樂死然后從農(nóng)場運送到解剖室，使用棉拭子進行口咽取樣，拭子儲存在保護性塑料套中，拭子在采樣點前后擦拭一次，然后拭子轉(zhuǎn)移到另外一個新的保護性塑料套中（內(nèi)含500μL PBS）并儲存在冰上?？谘适米哟鎯υ?80°C直到下一步的DNA提取。

2）肺液取樣：頸部的腹面被剃光，使用無菌手術(shù)刀切開皮膚及皮下組織然后暴露腹面氣管，在暴露的腹面部位確定一個采樣點，采樣點氣管使用結(jié)扎線和鉗夾法完全封閉。選定的采樣點加熱燒灼，將50毫升PBS經(jīng)燒灼部位注入氣管腔，PBS會流下胸部的尾部，第二個夾子立即放在注射部位尾部，以防止倒流、滲漏和潛在污染。將羊羔尸體傾斜，使PBS流向肺部，然后翻倒，液體聚集在氣管腔內(nèi)直到到第二個夾子的位置。在氣管的腹表面燒灼選擇一個取樣點，然后用針頭和注射器收集匯集液。每個樣本平均收集4 ± 1.7 ml肺液，然后放在冰上，肺液13000g離心5分鐘，棄上清液，沉淀用500μL PBS懸浮。肺液被存儲在?80°C直到下一步的DNA提取。

技術(shù)手段

16S rDNA擴增子測序（V2–V3）

研究結(jié)果

1、 方法質(zhì)控

平均每個樣本得到138,125 ± 29,306條序列，共得到750個OTUs，Good’s coverage指數(shù)為99.9%，表明樣本中99.9%的細菌被鑒定到。

2、 羔羊口咽拭子分為兩種不同群落類型

使用拉普拉斯近似分析可以將40個羔羊口咽拭子樣本基于細菌種類分為兩個獨立組：口咽型拭子和瘤胃型拭子（圖1, 2），口咽型拭子主要由巴斯德菌科(22%), 曼氏桿菌(14%),梭桿菌 (11%), Bibersteinia trehalosi (8%), 奈瑟桿菌(7%), 莫氏桿菌(6%), 比伯斯坦桿菌 (5%) 。而瘤胃型拭子主要包括普雷沃菌屬（36%）、梭菌目（11%），疣微菌科（7%）、毛螺菌科（6%）和丁酸弧菌屬（6%）?？谘市?/span>拭子和瘤胃型拭子在微生物多樣性方面沒有顯著差異。

3、 叉狀分枝的口咽菌群與不同肺菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)

肺液樣品最常見的OTUs是馬胃葡萄球菌;（13%），金黃色葡萄球菌（6%）、曼氏桿菌（5%）和普雷沃菌屬（5%）。使用拉普拉斯近似分析肺液沒有像口咽樣本分成2個組，然后手工將肺液分成與拭子各自相同的兩組：口咽型和瘤胃型（圖1, 2）：例如普雷沃菌和鞘氨醇桿菌是羊羔指示菌，其來源于瘤胃型拭子，噬氨副球菌也是羊羔指示菌，其則來源于口咽型拭子。比較了瘤胃型拭子中優(yōu)勢OTUs比例和其在肺液樣本中的相應(yīng)比例：平均而言這些OTUs在肺中的比例如下：普雷沃菌（5%）、梭菌目（2%），Ruminococcaceae（3%），毛螺菌科（1%）和丁酸弧菌屬（1%）。總體看來，羊羔肺部菌群與口咽菌群結(jié)構(gòu)不同。

圖1  PCOA 分析顯示羔羊口咽拭子樣本基于細菌種類分為兩個獨立組（紅色和紫色），肺液樣本分成相同的組（綠色和橙色）。肺液樣本和口咽樣本明顯分別聚集。

圖2  羊羔肺液、口咽拭子，提取試劑盒和PBS對照組發(fā)現(xiàn)的OTUs。綠色：劃分瘤胃細菌群落的口咽拭子；紅色：劃分口咽型細菌群落的口咽拭子；粉紅色：劃分瘤胃細菌群落的肺液；藍色：劃分口咽型細菌群落的肺液

4、 肺特有菌群的存在

指示菌種分析確定數(shù)個OTUs在肺液中相對于口咽拭子更顯著富集（表2）。開始認為試劑污染是導(dǎo)致的這個結(jié)果，因為相對于口咽拭子樣本，試劑污染會對肺液樣本產(chǎn)生更大的影響，由于其較低的生物量。然而當(dāng)檢查指示菌種時，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品中這些OTUs的比例并不完全相同。在這些指示菌種，最常見的是葡萄球菌，其在肺液中的比例為13.3%，其在對照組和口咽拭子樣本中比例非常少。

表2  示菌種分析確定數(shù)個OTUs在肺液中相對于口咽拭子更顯著富集

結(jié)論

●  口咽拭子樣本通常被與瘤胃常見細菌（瘤胃型）或上呼吸消化道常見細菌（口咽型）所主導(dǎo)。

●  肺部微生物不同于上呼吸消化道或?qū)φ?，在肺液中發(fā)現(xiàn)了一些瘤胃相關(guān)細菌，表明其確實吸入了瘤胃細菌。

●  還發(fā)現(xiàn)了幾種細菌，它們在肺液中比上呼吸道分泌物中更豐富，其中最主要的為葡萄球菌。

●  與人類相反，發(fā)現(xiàn)羊羔肺部與上呼吸消化道菌群并不相同，認為這可能與綿羊與人類生理和解剖學(xué)上的差異有關(guān)。