天昊客戶文章：功能性胃腸病患者的腸道細菌與Toll樣受體表達相關(guān)

發(fā)稿時間：2017-12-22來源：天昊生物

山西醫(yī)科大學附屬山西省人民醫(yī)院消化科王俊平教授課題組近期在《World Journal of Gastroenterology 》上發(fā)表了功能性胃腸病患者的糞便和黏膜菌群與Toll樣受體2／Toll樣受體4表達相關(guān)性的研究。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的擴增子測序和生物信息分析工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。 

英文題目：Faecal and mucosal microbiota in patients with functional gastrointestinal disorders: Correlation with toll-like receptor 2/toll-like receptor 4 expression

中文題目：功能性胃腸病患者的糞便和黏膜菌群與Toll樣受體2/4表達之間的相關(guān)性

期刊名：World Journal of Gastroenterology     發(fā)表時間： 2017    IF：3.365        

研究背景

最近的研究表明，腸道糞便（LM）微生物群和黏膜（MAM）微生物群組成是不同的，這表明這兩種微生物菌群在腸道微生態(tài)系統(tǒng)中起著不同的作用，腸道糞便微生物群（LM）是整個腸道排出的終產(chǎn)物，而黏膜（MAM）微生物群常常代表某個特定部位的菌群特點，因為MAM與宿主緊密接觸，可能在腸道屏障方面有突出的作用，而LM可能在營養(yǎng)代謝和養(yǎng)分捕獲方面起著關(guān)鍵的作用。

Toll樣受體（TLR）是固有免疫中模式識別受體，由胃腸道中的各種細胞表達。TLRs能識別各種微生物產(chǎn)物，在先天和適應性免疫途徑激活方面起著非常重要的作用，其中TLR2和TLR4是研究最深入的兩個，它們能對微生物膜組件響應。已經(jīng)有許多研究證明了TLR信號在微生物引起的慢性炎癥和免疫病中所起的重要作用，TLR可以直接與微生物互作，從而調(diào)節(jié)腸道免疫反應，在一些腸道疾病中，如炎癥性腸病（IBD）或腸易激綜合征（IBS），發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4的表達增加，并觀察到微生態(tài)失調(diào)。然而，目前關(guān)于人類腸道菌群與TLR之間關(guān)系的數(shù)據(jù)還比較有限。

研究目的

對功能性胃腸病患者（FGIDs）中腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）微生物菌群進行比較，研究菌群與Toll樣受體TLR2和TLR4表達之間的相關(guān)性，從而調(diào)查哪些類型細菌調(diào)控TLRs的表達從而影響腸道的功能。

研究對象

共32名18-65歲的中國功能性胃腸病患者（FGIDs），其中包括14名腹瀉型腸易激綜合征患者，14名功能性消化不良（FD）患者，4名其它疾病患者。研究人群男女各半，平均年齡為49（20-65）歲，BMI平均為23.24kg/m²。參加這項研究的受試者在研究前6個月內(nèi)沒有服用糖皮質(zhì)激素、阿片類藥物、益生菌或抗生素類藥物；無系統(tǒng)性合并癥；無過量飲酒史；有胃腸道手術(shù)史或腸道器質(zhì)性疾病的患者被排除在外；所有受試者在參與之前都簽署知情同意書。從32個患者中收集了64個樣本。每個患者同時提供一個糞便樣品和一個結(jié)腸黏膜樣品。

糞便樣品采集和DNA抽提：

在結(jié)腸鏡檢查前在家收集糞便樣品。樣品立即冷凍在-20°C，在6h內(nèi)運輸?shù)窖芯恐行模诜治銮耙恢贝娣旁?/span>-80°C，從糞便樣品中抽提細菌DNA采用QIAamp? DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取DNA。

黏膜樣品采集和DNA抽提：

結(jié)腸黏膜活檢樣本在一次非彈性的結(jié)腸鏡檢查中收集，結(jié)腸黏膜活檢取自降結(jié)腸。從結(jié)腸取出后，活檢樣本立即儲存在-20°C，在6h內(nèi)運輸?shù)窖芯恐行?，在分析前一直存放?/span>-80°C，使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 提取DNA。

qPCR檢測TLR2和TLR4表達：

從結(jié)腸活檢樣本中使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa, Japan)提取總黏膜RNA，qPCR檢測TLR2和TLR4基因表達量。

測序技術(shù)

16S rRNA擴增子測序（V3-V4）； 

研究結(jié)果

1. 腸道糞便樣品表現(xiàn)出比黏膜樣品更明顯的多樣性和豐富性，并且兩者的菌群結(jié)構(gòu)顯著不同。

2. 腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）微生物群之間門分類水平上存在顯著差異。例如LM中的主要菌群為擬桿菌門和厚壁菌門，其次是變形菌門，而MAM中最主要菌群為變形菌門，其次就是厚壁菌門和擬桿菌門。

3. 檢測了所有樣本中TLR2和TLR4的mRNA表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR2的表達與TLR4呈顯著正相關(guān)。

圖3  TLR2的表達與TLR4呈顯著正相關(guān)性

4. 在腸道糞便樣本（LM）中，無論門、綱、目水平，沒有細菌與TLR4表達呈相關(guān)性。而在粘膜樣本（MAM）中，Firmicutes（門水平）；Clostridia（綱水平）；Clostridiales（目水平）；Defluviitaleaceae、Peptostreptococcaceae、Ruminococcaceae（科水平）；Faecalibacterium、Ruminococcus（屬水平）分別與TLR4表達顯著負相關(guān)（圖4）。

5. 腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）樣本中的細菌與TLR2表達相關(guān)，然而菌群類型卻很不同。在腸道糞便（LM）樣本中，Clostridia、Bacilli（綱水平）；Clostridiales、Lactobacillales（目水平）；Ruminococcaceae、Streptococcaceae（科水平）；Faecalibacterium、Streptococcus（屬水平）分別與TLR2表達顯著負相關(guān)（圖4）。

6. 在黏膜（MAM）樣本中，Bacilli（綱水平）；Lactobacillales（目水平）；Carnobacteriaceae、Streptococcaceae（科水平）；Granulicatella、Streptococcus（屬水平）分別與TLR2表達顯著負相關(guān)（圖4）。

圖4糞便（LM）和粘膜（MAM）樣本相關(guān)關(guān)鍵菌屬和Toll樣受體TLR2和TLR4之間的相關(guān)性。藍圈

表示正相關(guān)，而紅圈代表負相關(guān)。

研究結(jié)論

中國功能性胃腸病患者（FGIDs）的腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）的微生物組成顯著不同。Toll樣受體的表達可能是受腸道特定類型細菌的影響。