天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget?檢測技術動物領域再發(fā)新文

發(fā)稿時間：2018-04-12來源：天昊生物

繼天昊MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術動物領域首發(fā)文章后，南京農(nóng)業(yè)大學動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實驗室利用MethylTarget^?技術近期又在《Comparative Biochemistry and Physiology》雜志上發(fā)表了母雞補充甜菜堿通過DNA甲基化修飾來調控F1代公雞下丘腦膽固醇代謝相關基因表達的文章。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們再跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Dietary betaine supplementation in hens modulates hypothalamic expression of cholesterol metabolic genes in F1 cockerels through modification of DNA methylation

中文題目：母雞補充甜菜堿可以通過DNA甲基化修飾來調控F1代公雞下丘腦膽固醇代謝相關基因的表達

期刊名：Comparative Biochemistry and Physiology, Part B     影響因子： 1.757

技術：MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術

實驗描述如皋黃羽蛋雞隨機分為基礎飼料組和補充甜菜堿(0.5%)喂養(yǎng)組，喂養(yǎng)30天后，收集雞蛋進行孵化，孵化的小雞相同條件下生長56天，然后進行稱重和取樣。取頸靜脈至肝素抗凝管，3000×g離心，4°C 10分鐘制備血漿。解剖下丘腦，迅速在液氮中冷凍，然后儲存在?70°C作進一步分析。

研究目的: 

甜菜堿廣泛應用于動物營養(yǎng)，作為蛋氨酸代謝中的甲基供體可通過基因表達調控實現(xiàn)營養(yǎng)重編程。目前不清楚蛋雞喂養(yǎng)添加甜菜堿的飲食是否會影響F1代下丘腦的膽固醇代謝。

研究結果：

血漿和下丘腦膽固醇含量

母雞補充甜菜堿并沒有改變體重，但是F1公雞血漿總膽固醇和高密度脂蛋白（HDL-C）濃度顯著增加，此外，母雞喂養(yǎng)甜菜堿可顯著增加F1公雞下丘腦總膽固醇和膽固醇酯含量（表3）。

表2  體重；血漿中總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量；下丘腦中總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯含量。Tch：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白；BW, 體重； Free Cho：游離膽固醇；Cho Ester：膽固醇酯。

下丘腦膽固醇代謝基因的表達

母體喂養(yǎng)甜菜堿顯著上調下丘腦SREBP1, SREBP2, LDLR 轉錄水平（圖1A）和蛋白水平（圖1B）。在甜菜堿組HMGCR mRNA水平增加，而CYP46A1 mRNA水平下降。此外，在甜菜堿組ACAT1和APO-A1 mRNA水平均明顯升高。

圖1 母體補充甜菜堿對F1代下丘腦膽固醇代謝基因表達的影響。A.下丘腦中SREBP1, SREBP2, HMGCR, CYP46A1, ACAT1, APO-A, LDLR mRNA水平。B. SREBP1, SREBP2, LDLR蛋白水平。

下丘腦甲基轉移和神經(jīng)肽相關基因的表達

母體喂養(yǎng)甜菜堿可在轉錄（圖2A）和蛋白水平（圖2B）上使BHMT和DNMT1表達明顯增加。此外，與對照組相比，甜菜堿組中下丘腦BDNF和CRH mRNA水平表達顯著下調，而NPY mRNA表達顯著上調（圖2C）。

圖2  補充甜菜堿對F1代下丘腦甲基轉移和神經(jīng)肽相關基因表達的影響。A.下丘腦BHMT, DNMT1,DNMT3A mRNA表達水平。B. 下丘腦BHMT, DNMT1,DNMT3A 蛋白表達水平。C. BDNF, NPY, CRH mRNA表達水平。

下丘腦SREBP1, SREBP2, APO-A1等基因啟動子CpG甲基化

對下丘腦基因組DNA進行了MethylTarget^?技術分析（mean coverage of> 600×），結果發(fā)現(xiàn)SREBP1, SREBP2, APO-A1等基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)受母體喂養(yǎng)甜菜堿調節(jié)。SREBP1(?1350 to ?1199), SREBP2 (?2030 to ?1612), APO-A1 (?725 to ?505)等基因的近端啟動子區(qū)被用于甲基化分析（圖3）。SREBP1啟動子區(qū)段包括包含11個CpG位點，這些CpG位點在甜菜堿組相對于對照組都是低甲基化。SREBP2啟動子區(qū)段包括包含4個CpG位點，其中3個CpG位點在甜菜堿組相對于對照組是低甲基化的， 另外1個CpG位點則是在甜菜堿組高甲基化。APO-A1啟動子區(qū)段包括包含5個CpG位點，這些CpG位點在甜菜堿組相對于對照組都是低甲基化?？偟膩碚f，SREBP1, SREBP2, APO-A1所檢測的3個片段平均甲基化程度在甜菜堿組明顯降低，這與它們的mRNA豐度呈負相關。

圖3  F1代下丘腦SREBP1,SREBP2,APO-A1基因啟動子甲基化狀態(tài)。 SREBP1 (?1350–?1199), SREBP2 (?2030–?1612)和APO-A1 (?727–?505) 5’側翼啟動子序列示意圖。SREBP1, SREBP2, 和APO-A1 啟動子區(qū)域平均甲基化狀態(tài)（左圖）和差異甲基化CpG位點（右圖）。

總結：◆

•  甜菜堿組血漿總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇含量顯著升高，下丘腦中總膽固醇和膽固醇酯含量也顯著升高。
• 相應的，下丘腦SREBP2, HMGCR, LDLR, SREBP1, ACAT1，APO-A1等基因表達顯著上調，CYP46A1表達上調，這些變化與BDNF和CRH表達顯著下調以及NPY表達顯著上調有關。
• 此外，參與甲基轉移循環(huán)的基因也被調控，例如DNMT1和BHMT的mRNA和蛋白水平都顯著上調，這與SREBP-1, SREBP-2，APO-A1等基因的啟動子CpG甲基化明顯修飾相關。
• 這些結果表明，蛋雞喂養(yǎng)甜菜堿可以通過啟動子DNA甲基化修飾來調控F1代公雞下丘中參與膽固醇代謝和腦功能相關基因的表達。

天昊創(chuàng)新性MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術：

• 性價比高：傳統(tǒng)克隆測序一個片段10個克隆的價格，MethylTarget可以完成約60個片段的檢測（檢測深度為1000X，相當于1000個克?。?
• 精確度高：基于二代測序數(shù)據(jù)檢測甲基化程度，精確到單堿基分辨率，與基于測序的全基因組甲基化測序，RRBS數(shù)據(jù)有高度一致性
• 精確定量：測序深度高達1000X，并可以進一步加深，相比于傳統(tǒng)克隆測序，可以對位點甲基化程度進行準確定量
• 技術靈活：基于多重PCR富集進行目標區(qū)域富集，可隨時進行基因和位點的變化和改動，并且可以獲得每個片段的甲基化單倍型