【昊閱讀】微衛(wèi)星擴增誘導(dǎo)了內(nèi)含子的保留可以作為疾病生物標志物

發(fā)稿時間：2018-05-14來源：天昊生物

許多遺傳性神經(jīng)和神經(jīng)肌肉疾病是由短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星的異常擴增引起的，導(dǎo)致具有病理性質(zhì)的重復(fù)擴增RNAs和蛋白質(zhì)的表達。盡管這些微衛(wèi)星擴增可能發(fā)生在基因組的編碼區(qū)或非編碼區(qū)，但三核苷酸CNG重復(fù)序列在外顯子編碼區(qū)和非翻譯區(qū)占主導(dǎo)地位，而內(nèi)含子突變從三核苷酸到富含六核苷酸GC和富含A / AT的重復(fù)序列變化。在此，本研究使用轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合互補實驗方法來證明富含GC的內(nèi)含子擴增與宿主內(nèi)含子保留選擇性相關(guān)。由于這些內(nèi)含子保留事件在受影響的組織和外周血中都是可檢測的，因此它們提供了敏感和疾病特異性的診斷生物標記。

 

發(fā)表期刊：PNAS 發(fā)表時間：2018-4-17 影響因子：9.661

摘要一覽：

簡單序列重復(fù)序列或微衛(wèi)星的擴增與30種神經(jīng)肌肉疾病有關(guān)。雖然這些擴增發(fā)生在編碼區(qū)和非編碼區(qū)，但微衛(wèi)星序列和重復(fù)長度多樣性在內(nèi)含子中更為突出，內(nèi)含子具有8個不同的三核苷酸至六核苷酸重復(fù)序列，導(dǎo)致遺傳性疾病，如肌強直性營養(yǎng)不良2型( DM2 )、Fuchs內(nèi)皮角膜營養(yǎng)不良( FECD )和C9orf 72肌萎縮性側(cè)索硬化和額顳葉癡呆( C9-ALS / FTD )。在這里，研究人員檢驗了這些富含GC的內(nèi)含子微衛(wèi)星擴增選擇性地觸發(fā)宿主內(nèi)含子保留( IR )的假設(shè)。以DM2、FECD和C9-ALS / FTD為例，本研究證明在受影響的組織和外周血淋巴細胞中容易檢測到保留，并得出結(jié)論，即IR篩選是內(nèi)含子重復(fù)擴增疾病的快速且廉價的生物標記物。

背景簡介：

重復(fù)元件是真核基因組DNAs的常見序列特征，占人類基因組的70%。這些重復(fù)序列包括轉(zhuǎn)座子家族( DNA轉(zhuǎn)座子和LTR以及非LTR反轉(zhuǎn)座子)和簡單序列重復(fù)，例如端粒重復(fù)和各種衛(wèi)星(著絲粒、微衛(wèi)星、微衛(wèi)星和兆衛(wèi)星)。微衛(wèi)星是≤10個堿基對(bp)的重復(fù)單元，是一個特別突出的重復(fù)元件類，因為它們由于傾向于形成不完全發(fā)夾、滑鏈、四鏈狀等而具有高度多態(tài)性導(dǎo)致DNA復(fù)制和修復(fù)水平升高的結(jié)構(gòu)錯誤。雖然這些錯誤會導(dǎo)致重復(fù)收縮和擴增，從而提供有益的基因調(diào)節(jié)活性，但擴增會導(dǎo)致30種人類遺傳性疾病。盡管與外顯子相比，人類內(nèi)含子在重復(fù)元件中顯著較長且較密集，但只有8種內(nèi)含子微衛(wèi)星擴增障礙與內(nèi)含子重復(fù)不穩(wěn)定性相關(guān)。

 

研究方法：

Southern印跡、重復(fù)序列引物PCR檢測、RNA-FISH、小基因剪接報告基因、體內(nèi)電穿孔、RT-PCR、RNA-Seq、CAGE-Seq、Microarray。

 

研究結(jié)果：

1、內(nèi)含子微衛(wèi)星擴張的序列多樣性和位置偏差分析

人類基因組在內(nèi)含子中含有80000個3至6 bp的微衛(wèi)星，這些微衛(wèi)星可能會發(fā)生擴增，但目前只有8個串聯(lián)重復(fù)序列遺傳性擴增疾病被報道。雖然富含GC的三核苷酸擴增(exp)在外顯子區(qū)域占主導(dǎo)地位，但內(nèi)含子突變由3至6 bp重復(fù)組成，GC含量(20-100%)差異很大?；谠撔蛄刑卣?，本研究將內(nèi)含子擴增分為GC和A/AT富集基團(圖1A )。與大多數(shù)富含A/AU的微衛(wèi)星RNA相反，預(yù)測富含GC的擴增形成高度穩(wěn)定的RNA二級結(jié)構(gòu)，顯著為增加內(nèi)含子長度(圖1B)，甚至多次倍增內(nèi)含子長度，例如NOP56中SCA36相關(guān)的GGCCTG^exp突變。SCA10 AUUCU重復(fù)序列也由AU對折疊成閉合的UCU內(nèi)環(huán)組成的二級結(jié)構(gòu)，但是這些結(jié)構(gòu)與由可變長度的富含GC的重復(fù)序列形成的發(fā)夾和G -四鏈體相比相對不穩(wěn)定。

為了鑒別致病性內(nèi)含子微衛(wèi)星與未擴增重復(fù)元件的區(qū)別特征，本研究繪制了內(nèi)含子中重復(fù)元件的位置圖，并指出與疾病相關(guān)的微衛(wèi)星定位于剪接位點(ss)，富含GC微衛(wèi)星定位于剪接位點的0.07 - 0.8 kb范圍內(nèi)，而富含A/AT重復(fù)定位于1.3 - 75.9 kb，通常位于下游內(nèi)含子中(圖1A )。因為前人研究已知RNA結(jié)構(gòu)和微衛(wèi)星都會影響剪接調(diào)控，這些觀察結(jié)果導(dǎo)致研究者推測富含GC的內(nèi)含子微衛(wèi)星擴增改變了RNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致剪接體的損害。因此，研究者測試了富含GC微衛(wèi)星擴增是否導(dǎo)致受影響的大腦和肌肉組織以及更易獲得的宿主細胞和組織(包括成纖維細胞和血液)中內(nèi)含子的錯誤產(chǎn)生。

 

 

圖1、富含GC和A/AT的內(nèi)含子微衛(wèi)星擴增突變。(A) 位于非翻譯區(qū)( UTRs )、編碼序列( CDS )，以及內(nèi)含子中的疾病相關(guān)微衛(wèi)星序列。 ( B )內(nèi)含子微衛(wèi)星疾病和相關(guān)基因微衛(wèi)星剪接位點鄰近排布，分別展示了宿主內(nèi)含子(白色條)及相對的重復(fù)擴增(彩色條)相對長度及序列。

 

2、CNBP內(nèi)含子1在DM2中的保留性檢測

為了檢驗富含GC擴增破壞了其宿主內(nèi)含子的剪接，研究者首先選擇了DM2 CCTG^exp突變，因為它是迄今為止報道的最大的微衛(wèi)星擴增。CNBP也是最廣泛和高度表達的內(nèi)含子擴增疾病基因，增強了研究者測量其在各種組織中的RNA加工模式能力的自信。

為了檢測潛在的CNBP前mRNA錯誤處理，研究者從DM2、相關(guān)疾病DM1、Duchenne肌營養(yǎng)不良癥( DMD )和未受影響的骨骼肌和心肌獲得的可公開獲得的鏈特異性RNA測序(RNA-seq )數(shù)據(jù)集。如預(yù)測結(jié)果一致，在各種DM2肌肉中觀察到CNBP i1上的相關(guān)reads覆蓋，但在對照樣品中沒有觀察到(圖2A )。對于所有RNA-seq實驗，本文進行了三個不同的度量: ( I )跨越內(nèi)含子-外顯子連接的讀數(shù)的相對富集；( ii )保留內(nèi)含子中每個堿基對的平均讀取覆蓋率；和( iii )使用IRFinder的所有四個CNBP內(nèi)含子的內(nèi)含分子的分數(shù)( IR比)。正如所預(yù)期的那樣，IR以～0.35的IR比特異性在DM2 CNBP i1中升高，而內(nèi)含子2、3和4的剪接不受影響(圖2B)。為了使用額外的患者樣本和替代性實驗方法確認CNBP i1保留，研究者分析了從DM2、DM1、面部肩胛肱型肌營養(yǎng)不良癥( FSHD )和未受影響的對照肌肉活檢獲得的微陣列數(shù)據(jù)集，并觀察到與該大對照群組相比，DM2中的CNBP i1保留具有統(tǒng)計學顯著性和特異性(圖2C)。對其他肌營養(yǎng)不良癥的分析增加了研究者的信心，即CNBP i1的保留是DM2特異性的，而不是反映在一般肌病特征。由于CNBP i1發(fā)生雙向轉(zhuǎn)錄，研究者量化了鏈特異性RNA-seq reads覆蓋率，以確認分析沒有被反義轉(zhuǎn)錄混淆，發(fā)現(xiàn)99.9 %以上的RNA來自肌肉中。

采用RT-PCR方法對脛骨前肌活檢標本中CNBP i1的保留率進行驗證。因為在這些樣品中RNA降解被最小化。來自3’ss的IR檢測允許從前RNA中間體選擇性擴增保留的內(nèi)含子并同時分析內(nèi)含子1、2和3 (圖2D )。與整個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，研究者還檢測到與疾病和未受影響的對照相比，DM2活檢骨骼肌(圖2E和F )、大腦額葉皮質(zhì)和淋巴母細胞樣細胞系( LCLs ) (圖2G )中的CNBP i1保留率有選擇性，最多增加近6倍。

接下來，研究者討論了CNBP i1是保留的還是不保留的內(nèi)含子的問題，因為后者是不完全剪接的RNA，不輸出到細胞質(zhì)。CCUG^exp RNA的亞細胞定位通過使用重復(fù)特異性探針的RNA - FISH在患者來源的成纖維細胞中檢測到，盡管在細胞核中病灶中突變RNA的水平較高，但CCUG^exp RNA也容易在DM2但不是對照細胞的細胞質(zhì)中檢測到(圖2H)。這種原位分析通過對照和DM2成纖維細胞的亞細胞分級以及隨后的RT-PCR證實。使用3’ss和5’ss RT-PCR檢測，與對照不同，含CNBP i1的mRNAs在DM2的細胞質(zhì)中明顯可見(圖2I)。最后，通過用G418處理細胞以誘導(dǎo)PTC穿透，研究者確定CNBP i1的保留是否導(dǎo)致過早終止密碼子(PTC)和無意義序列介導(dǎo)的衰變(NMD)的引入。對于DM2成纖維細胞G418顯著提高IR比率，表明NMD降低了含CNBP i1的mRNA的細胞質(zhì)水平。因此，多種實驗方法和患者樣品證實了CNBP i1在DM2組織和細胞中的選擇性保留，并且CCUG擴增與體內(nèi)和細胞培養(yǎng)物中的IR相關(guān)。

 

圖2、圖2。CNBP內(nèi)含子1在DM2中的保留。(A) UCSC中CNBP基因的基因組示意圖，顯示內(nèi)含子CCTG位置(三角形)。Wiggle圖表示DM2骨骼肌(腓腸肌、胸肌和股四頭肌)和心臟與疾病控制骨骼肌(DM1三角肌、趾肌、腓腸肌和直腸；DMD二頭肌、股四頭肌和TA)和未受影響的對照心臟和三頭肌RNA-seq數(shù)據(jù)。(B) CNBP IR ratios。(C)人微陣列分析7個DM2、8個FSHD和8個未受影響的對照組股外側(cè)活檢以及8個DM1尸檢肌肉的4個CNBP內(nèi)含子相對于絕對外顯子信號的倍數(shù)變化。(D) CNBP i1 5’ss (3-引物)和3’ss (2-引物) RT-PCR檢測的示意圖。IR比率反映保留i1的同工型相對于其它PCR產(chǎn)物的相對量。(E)對年齡匹配的活檢DM2 (n = 4)和未受影響的對照(n = 4) TA肌肉的CNBP i1保持率進行RT-PCR分析。( F )基于CNBP i1 5’ss和3’ss RT-PCR分析計算的異構(gòu)體比率。(G) DM2 (n = 18)、DM1 (n = 14)和ALS (n = 11)的CNBP i1 5’ss和3’ss分析。條形圖顯示了CNBP i1保持率的平均值SD。(H)使用重復(fù)特異性探針CAGG8-Cy3在DM2成纖維細胞中檢測CCUG^exp的RNA-FISH。細胞核是基于DAPI染色勾畫的。(I)亞細胞分級DM2成纖維細胞證實細胞質(zhì)中存在CNBP i1 mRNA。用CNBP i1 5’ss和3’ss RT - PCR分析DM2和對照成纖維細胞細胞核和細胞質(zhì)組分。

 

3、宿主內(nèi)含子保留可作為易獲得的生物標記

為了檢測CNBP i1的保留作為潛在的血液生物標記物，研究者從DM2患者血液以及疾病(DM1和ALS)和未受影響的對照組中分離外周血淋巴細胞(PBLs)。與其它組織中的發(fā)現(xiàn)一致，與對照相比，在DM2 PBLs中CNBP i1的保留增強，而在DM2中內(nèi)含子2、3和4的剪接未被破壞，并且ALS樣品中的所有CNBP內(nèi)含子被剪接(圖3A和B)。為了闡明IR與CCTG^exp長度之間的關(guān)系，對DM2患者的PBLs進行基因組DNA Southern印跡分析，所述PBLs分為未攜帶 (對照，DM1 )、少量( 100 - 400 CCTGs；這些患者中的一些是癥狀發(fā)生前的)或大量(>1000 CCTGs ) CNBP擴張(圖3C )。DM2、DM1和ALS PBLs的RT - PCR分析表明，CNBP i1的保留依賴于重復(fù)長度(圖3D )，在具有較大擴增的DM2 PBLs與未受影響的疾病( DM1和ALS )對照(圖3E )之間i1保留增加了四倍。有趣的是，主要具有小擴增的PBLs也顯示出CNBP i1保留率比對照增加了兩倍，盡管這些群體也顯示出長度鑲嵌，在降低的水平上可檢測到較大擴增。為了檢查內(nèi)含子保留是否限于突變的CNBP等位基因，研究者利用了先前報道與突變的DM2等位基因連接的DM2連鎖的A>C ( rs1871922 ) CNBP i1 SNP。使用CNBP i1 5’ss分析引物，研究者利用DM2 PBLs和成纖維細胞擴增基因組DNA (gDNA)和cDNA進行了Sanger測序，結(jié)果顯示與gDNA相比，cDNA中DM2連鎖的SNP過度表達，表明i1優(yōu)先包含在突變CNBP RNA中(圖3F )。因為DM2是顯性疾病，并且CNBP i1保留信號被來自未擴增等位基因的轉(zhuǎn)錄物稀釋，我們還證實，在純合子與雜合子DM2患者成纖維細胞中CNBP i1保留率是兩倍高(圖3G)。基于這些觀察，本文得出結(jié)論，內(nèi)含子保留是一種有用的DM2血液生物標記。

 

 

 

圖3、CNBP內(nèi)含子1在DM2中的保留作為血液生物標志物。( A )來自DM2 ( n = 3 )和ALS ( n = 5 )對照的PBL RNA-seq數(shù)據(jù)的CNBP和UCSC示意圖。( B )由IRFinder計算的CNBP i1保留率。 ( C )來自DM2患者PBLs的基因組DNA的Southern印跡分析。( D )對DM2患者外周血淋巴細胞進行CNBP i1 3’ss逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析。( E )條形圖顯示CNBP i1保持率的平均值SD。( F ) CNBP i1保留的mRNA對突變等位基因是特異性的。gDNA與cDNA的Sanger測序結(jié)果表明，DM2特異性單核苷酸多態(tài)性在mRNA / cDNA群體中占優(yōu)勢。(G)雜合和純合DM2和對照成纖維細胞的CNBP i1 3’ss分析。( H )小鼠Uba5模型構(gòu)建，其具有插入外顯子2 5’ss下游的6個、140個或280個CCTG重復(fù)。( I )小鼠TA肌肉用構(gòu)建體電穿孔( n = 4 )，1周后通過RT - PCR評估Uba52 I2保留。

 

4、微衛(wèi)星擴增疾病中內(nèi)含子在富含GC而不是富含A/AT中的錯誤剪切

為了檢測富含GC但不富含A / AT的微衛(wèi)星擴增是否導(dǎo)致選擇性IR，研究者比較了另外兩種富含GC和A / AT的微衛(wèi)星擴增疾病的IR。FECD是由TCF4 i3中的CTG^exp引起的，但是與DM2 CCTG^exp相反，該突變位于內(nèi)含子的中間，并且CTG^exp顯著較小( <1.7 kb )。為了檢測可能的TCF4 i3保留，研究者檢索了從FECD和對照角膜內(nèi)皮樣品獲得的公開可用的RNA-seq數(shù)據(jù)集。與DM2 CNBP i1相似，研究者在FECD中觀察到TCF4 i3 reads覆蓋的增加，但在未受影響的對照中沒有觀察到(圖4A )，平均IR比率～0.18?？鏣CF4 i3的FECD reads分布偏向5’端，并且由于在該區(qū)域中存在具有多個5’ss的備選第一外顯子( AFE )而變得復(fù)雜(圖4A )。因此，為了證實保留，研究者分析了支持i3和側(cè)翼外顯子之間的覆蓋的reads的相對富集和TCF4 i3上的平均每核苷酸reads覆蓋。正如預(yù)期的那樣，這兩個度量都在FECD樣本中得到富集。盡管在FECD RNA-seq數(shù)據(jù)集中不能區(qū)分有義和反義reads，但通過鏈特異性基因表達(CAGE)-seq分析測試反義轉(zhuǎn)錄是否發(fā)生在該位點，并發(fā)現(xiàn)有義而非反義轉(zhuǎn)錄起始位點是可檢測的。本研究中使用的其他鏈特異性RNA-seq數(shù)據(jù)集的分析也未能檢測到跨該區(qū)域的反義轉(zhuǎn)錄。

接下來，研究者在C9-ALS / FTD中檢測IR，其中GGGGCC^exp突變位于AFEs 1a和1b之間的C9orf72 i1中(圖S1 )。富含GC的重復(fù)序列的擴增改變了外顯子1a和1b上游啟動子的活性，盡管后者的轉(zhuǎn)錄受到更嚴重的損害。為了確定這種類型的擴增突變是否也導(dǎo)致腦和血液中的IR，研究者使用來自C9-ALS/FTD和對照樣品的RNA-seq鏈特異性數(shù)據(jù)集評估C9orf72 i1的保留。與來自細胞系的先前結(jié)果一致，研究者觀察到C9-ALS/FTD皮層和小腦中C9orf72 i1上的RNA-seq reads覆蓋增加，但在散發(fā)的ALS和未受影響的對照腦樣品中，盡管類似于FECD，但RNA-seq reads分布偏向該內(nèi)含子的5’端(圖4B )。由于先前在LCLs中注意到IR并且c9orf 72在髓系細胞中的表達特別高，研究者還分析了C9-ALS/FTD、sALS ( GGGCC^exp陰性)和DM2 PBLs的RNA-seq。與腦樣品相似，在PBLs中觀察到C9orf72 e1b下游～2.5 kb的高reads覆蓋率，這表明存在未標記的AFE和/或替代e1b 5’ss (圖4B )。與這種可能性一致，在C9orf72 i1和E2之間獲得剪接接頭reads，并且通過使用PBL、LCL和皮層樣品的RT-PCR和Sanger測序驗證先前未標記的接頭。為了測試是否存在新的AFE，研究者分析c9orf 72有義鏈CAGE-seq數(shù)據(jù)并鑒定支持存在新外顯子的讀數(shù)，將其命名為e1c，并且我們的分析得到fantom 5聯(lián)合體注釋轉(zhuǎn)錄物的證實。為了確定e1c在C9 - ALS / FTD腦中的表達是否改變，使用C9-37和500 BAC轉(zhuǎn)基因小鼠模型分別表達37或500個GGCC重復(fù)。使用人特異性C9orf72 e1c-E2引物，檢測到C9-500與C9-37相比信號升高，這表明存在GGGCC^exp DNA，可能是由于e1c轉(zhuǎn)錄起始增加引起的。

除了富含GC的DM2、FECD和C9-ALS / FTD突變外，研究者還檢測了兩個富含A / AT的擴增，FXN i1中的FRDA GAA^exp和ATXN10 i9中的SCA10 ATTCT^exp。盡管FRDA GAAexp突變降低了突變FXN等位基因的轉(zhuǎn)錄，但先前的研究報告了GAA^exp誘導(dǎo)雜交和FXN微基因剪接報告試驗中的內(nèi)含子錯分裂。然而，本研究未能檢測FXN i1在FRDA成纖維細胞和LCLs中的IR (圖4C )。此外，在SCA10小腦或成纖維細胞中未檢測到ATXN10 AUUCU^exp i9突變的IR (圖4D)。總之，本研究重復(fù)誘導(dǎo)的宿主內(nèi)含子錯誤產(chǎn)生是富含GC但不富含A/AT的微衛(wèi)星擴增疾病的一般特征。

 

圖4、由富含GC但不富含A / AT的微衛(wèi)星擴增突變誘導(dǎo)的內(nèi)含子保留。TCF4、C9orf72、FXN和ATXN10基因及其相應(yīng)內(nèi)含子CTG、GGGCC、GAA和ATCT擴增位置的UCSC數(shù)據(jù)RNA-seq示意圖。( A ) FECD和對照角膜內(nèi)皮細胞。( B ) c9orf 72 C9-ALS/FTD、sALS和DM2皮質(zhì)、小腦和PBL。( C ) FRDA和對照成纖維細胞和低密度脂蛋白。( D ) SCA10和對照小腦和成纖維細胞。

 

研究結(jié)論：

在本研究中，我們研究了與肌強直性營養(yǎng)不良2型( DM2 )、c9orf 72連鎖的GC和A/AT豐富內(nèi)含子微衛(wèi)星突變肌萎縮性側(cè)索硬化伴額顳葉癡呆(C9-ALS/FTD)，Fuchs內(nèi)皮型角膜營養(yǎng)不良(FECD)，弗里德里希氏病共濟失調(diào)(FRDA)和脊髓小腦共濟失調(diào)10型(SCA10)。證明富含GC的CCTG、GGGCC和CTG擴增分別導(dǎo)致DM2、C9-ALS/FTD和FECD中的宿主內(nèi)含子保留(IR)，而FRDA和SCA10中的富含A/AT的擴增則沒有?；谶@些和額外的觀察，本研究提出IR作為診斷和治療試驗?zāi)康牡目色@得和廉價的生物標記物。

 

關(guān)于天昊：

天昊生物擁有多種SSR檢測平臺及SSRseq^TM等專利技術(shù)，可以根據(jù)客戶項目需求，提供不同數(shù)量樣本和位點的高性價比微衛(wèi)星檢測服務(wù)。