天昊客戶再發(fā)重磅研究 CNVplex?助力登陸Gastroenterology (IF:20.773)

發(fā)稿時間：2018-08-08來源：天昊生物

 

近日，天昊生物CNVplex^?高通量DNA拷貝數(shù)檢測技術助力蛋白質組學國家重點實驗室，北京蛋白質組研究中心周鋼橋教授和賀福初院士課題組，在著名胃腸病學雜志Gastroenterology(IF:20.773)上發(fā)表了題為“Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53”的研究。研究團隊基于CNV的全基因組關聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)染色體15q13.3位點的擴增（15q13.3 duplication）增加了乙肝病毒相關的肝細胞癌（HBV-related HCC）患病風險，而該位點的小核仁RNA(snoRNA) SNORA18L5促進了HCC的發(fā)生發(fā)展，并從機制上逐步深入分析了SNORA18L5參與的促進HCC形成的過程，以下是這篇文章的具體內容。

 

 

文章題目：Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53

期刊：Gastroenterology (IF:20.773)

接收時間：2018年4月19日

發(fā)表時間：2018年8月

 

研究背景

很多證據(jù)表明遺傳因素能夠影響乙肝病毒相關肝細胞癌（HBV-related HCC）的易感性，現(xiàn)有的研究主要基于SNP的全基因組關聯(lián)研究（GWAS）分析HCC的遺傳風險。除了SNP之外，CNV也與多種常見疾病有關聯(lián)，然而針對germline水平的CNV和HBV-related HCC并沒有相關的GWAS分析。因此本研究在中國人群中基于CNV的多階段GWAS分析拷貝數(shù)變異是否會影響HBV-related HCC的風險。

 

GWAS研究思路及主要結果

1. GWAS研究結果及分析：

GWAS發(fā)現(xiàn)階段，利用先前研究的芯片數(shù)據(jù)分兩步策略尋找CNV的關聯(lián)：確定的常見拷貝數(shù)多態(tài)性（CNPs）+新的未被確定的CNV分型，最后確定14個CNV位點與HBV-related HCC顯著相關（圖1）。

驗證階段，首先利用天昊生物CNVplex^?技術對14個CNV位點進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)僅一個CNV，低頻的15q13.3位點的擴增（15q13.3 duplication）與前期結果一致（圖2A）。然后利用qPCR技術在獨立的三組實驗中分別驗證該位點的拷貝數(shù)，重復性均較好。結合五個階段的case-control分析，15q13.3位點的擴增在case和control中的頻率分別為2.3%（36/1562）和0.2%（3/1533），與HBV-related HCC顯著相關（p = 3.17×10^-8，OR = 12.02）。

然后需要確定15q13.3 duplication是否為可遺傳的變異，利用芯片對205個家系進行研究發(fā)現(xiàn)，其中6個后代存在15q13.3位點的重復，而且均遺傳自他們的父母，表明了該位點的可遺傳性。

 

圖1 GWAS發(fā)現(xiàn)階段及驗證階段研究策略

研究人員利用原位雜交證實了15q13.3 duplication的存在（圖2B），而且多個數(shù)據(jù)庫的結果也驗證了這個位點在case和control中的突變頻率與現(xiàn)有結果一致（圖2C）。

 

圖2 15q13.3 duplication基因組定位

2. 15q13.3 duplication的精細定位及基因確定

結合數(shù)據(jù)庫和qPCR結果將15q13.3 duplication精細定位在最小為15.4 Kb的區(qū)域（29,997,395-30,012,769 bp），但是該區(qū)域中并沒有蛋白編碼基因，而是有一個小的核仁RNA(snoRNA) SNORA18L5（圖2C）。qPCR結果顯示在單核細胞樣本中SNORA18L5表達水平與其germline水平的拷貝數(shù)呈正相關（R = 0.85，p < 0.0001，圖2D），SNORA18L5是15q13.3 duplication區(qū)域一個合適的候選基因。

3. SNORA18L5基因表達和功能初探

與對照細胞或非瘤組織相比，SNORA18L5在多種HCC細胞系或組織中均表達上調（圖3A）。進一步發(fā)現(xiàn)SNORA18L5啟動子區(qū)域存在較高水平的H3K4me3修飾，兩者存在正相關（圖3B，3C）；使用MLL抑制劑處理HepG2細胞的時候，H3K4me3的富集及SNORA18L5表達水平均會下降（圖3D）。而且高表達的SNORA18L5與高AFP水平、較大的腫瘤尺寸、較晚TNM分期、微血管侵入均有顯著相關性（圖3E）；SNORA18L5高表達的HCC患者預后更差（圖3F）。這些結果進一步說明SNORA18L5可能是15q13.3 duplication的一個功能基因。

 

圖3 SNORA18L5上調受組蛋白修飾調控并且與HCC較差預后相關

4. SNORA18L5通過加速G1/S期轉變及抑制凋亡從而促進HCC細胞生長

在L-02和HepG2細胞中過表達SNORA18L5后顯著增加細胞增殖和菌落形成（圖4A，4B），in vivo結果也顯示過表達后腫瘤體積的增大（圖4C）。細胞周期分析發(fā)現(xiàn)過表達的SNORA18L5加速G1/S期轉變（圖4E），而且在H₂O₂處理HCC細胞后顯示出抗凋亡的影響（圖4F）。

 

圖4 SNORA18L5促進HCC腫瘤形成

5. SNORA18L5詳細調控機制

SNORA18L5過表達的細胞中成熟的18S和28S rRNAs水平顯著更高（圖5C），核糖體的合成也顯著增加（圖5E），而且在Act.D處理的細胞中過表達SNORA18L5能夠顯著減弱rRNA加工缺陷（圖5D）。因此SNORA18L5的出現(xiàn)能夠通過促進rRNA成熟從而減弱核糖體合成的壓力。

 

圖5 SNORA18L5通過促進rRNA成熟從而減弱核糖體合成的壓力

因為核糖體合成的缺陷會導致p53較穩(wěn)定的狀態(tài)并且誘導基于p53對細胞增殖的抑制，因此團隊針對SNORA18L5和p53之間的關系進行研究，發(fā)現(xiàn)SNORA18L5的存在抑制p53積累，依賴p53起到oncogene的作用。最后還發(fā)現(xiàn)SNORA18L5通過維持RPL5和RPL11兩種核糖體蛋白（RP）在核內來調控MDM2，SNORA18L5又促進MDM2調控的p53泛素化和降解（圖6，詳見參考文獻）。

 

圖6 SNORA18L5在HCC腫瘤發(fā)生過程中的功能模型

 

 

結論

在中國人群中基于多階段germline CNV的GWAS研究發(fā)現(xiàn)一個低頻的15q13.3 duplication與HBV-related HCC的易感性相關，而且驗證了SNORA18L5作為這個風險的CNV的靶點，通過促進rRNA的成熟，減弱核糖體合成壓力-RPs-MDM2-p53信號通過實現(xiàn)其oncogene的功能。

 

特別感謝

天昊生物特別感謝蛋白質組學國家重點實驗室，北京蛋白質組研究中心周鋼橋教授和賀福初院士課題組對天昊生物技術和服務的認可！天昊生物將長期致力于為分子生物學及醫(yī)學遺傳學領域的研究者提供高質量的科研策略咨詢、實驗技術服務和遺傳數(shù)據(jù)分析，幫助廣大科研人員獲得更為優(yōu)質的科研成果！

 

本成果參考文獻

Cao P, Yang A, Wang R, Xia X, Zhai Y, Li Y, Yang F, Cui Y, Xie W, Liu Y, Liu T, Jia W, Jiang Z, Li Z, Han Y, Gao C, Song Q, Xie B, Zhang L, Zhang H, Zhang J, Shen X, Yuan Y, Yu F, Wang Y, Xu J, Ma Y, Mo Z, Yu W, He F, Zhou G, Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53, Gastroenterology (2018), doi: 10.1053/j.gastro.2018.04.020.