天昊客戶新文：茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌定植線索

發(fā)稿時間：2018-08-21來源：天昊生物

南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院近期在土壤學(xué)領(lǐng)域一區(qū)雜志《Plant Soil》上發(fā)表了茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌分布的文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴增子測序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Colonization cues of leaf- and root-inhabiting bacterial microbiota of Atractylodes lancea derived in vitro and in vivo

期刊名：Plant Soil     

發(fā)表時間： 2018年6月

影響因子：3.052

研究背景: 

微生物群與植物在植物葉片或根系內(nèi)建立了穩(wěn)定的共生微生態(tài)系統(tǒng)。植物已經(jīng)進(jìn)化出了一套微生物群落定植機制來嚴(yán)格地篩選能夠進(jìn)入植物內(nèi)部的環(huán)境微生物。以往的研究表明，由于土壤微生物對根分泌物的趨化作用，土壤和根際微生物群落存在顯著差異。因為葉片表面入口點的限制以及和葉片營養(yǎng)成分較少導(dǎo)致空氣傳播細(xì)菌和葉片內(nèi)生細(xì)菌也有區(qū)別。植物葉或根可分別從空氣或土壤微生物群中選擇棲息的微生物群。葡萄微生物區(qū)系研究表明，盡管根棲細(xì)菌種群與葉棲細(xì)菌有顯著差異，但棲息于葉、花或葡萄上的細(xì)菌與土壤細(xì)菌共有的比例要高于它們相互之間共有的比例，這表明土壤細(xì)菌可以通過根運輸?shù)降厣?。目前認(rèn)為土壤微生物的來源是土壤和空氣中的微生物。目前還沒有直接的證據(jù)表明，葉或根棲息的細(xì)菌可以在根和葉片之間傳遞，另外在傳遞過程中，葉或根是否選擇細(xì)菌也是未知的。此外，以前的研究已經(jīng)表明，葉和根棲息的微生物影響植物性狀，特別是植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與葉或根中的微生物群密切相關(guān)。在傳遞和選擇過程中，葉片和根中的性狀相關(guān)微生物群可能對植物代謝系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響。

茅蒼術(shù)是一種瀕危的中草藥，具有廣泛的藥理活性，不僅與植物生長環(huán)境的非生物因素有關(guān)，而且與植物內(nèi)生菌和植物的共生過程有關(guān)。近年來的研究表明，葉片內(nèi)生細(xì)菌可選擇性地從空氣中獲得，根內(nèi)生細(xì)菌可選擇性地來自土壤，我們想知道茅蒼術(shù)葉片中是否也含有根部內(nèi)生細(xì)菌，同時根部內(nèi)生細(xì)菌是否也含有葉片內(nèi)生菌。

研究對象：

將茅蒼術(shù)組培苗1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月。然后將無菌茅蒼術(shù)組培苗移栽到特殊滅菌實驗裝置，其可以完全分離茅蒼術(shù)地上和地下部分（圖1）。分離裝置的葉室充滿空氣（自然或滅菌空氣），根室充滿土壤（自然或消毒土壤）。一個特殊的帽子（允許空氣通過，但不允許細(xì)菌通過孔徑）被擰到所有處理組根室和葉室的端口上。所有實驗裝置都在超凈工作臺上安裝，以確保在擰帽之前葉室中是無菌空氣。每隔5天在在超凈工作臺上向土壤中添加無菌水（5毫升）。四種處理方法為：SnAn：土壤/空氣均自然處理；SnAs：僅空氣無菌處理；SsAn：僅土壤無菌處理；SsAs：土壤/空氣均無菌處理（圖1）。所有處理均有3次生物學(xué)重復(fù)。九十天后，從四個處理中用無菌剪刀分離植物葉片和根樣品。通過連續(xù)洗滌和超聲處理去盡空氣和土壤來源的顆粒和附生細(xì)菌獲得葉和根組織，然后我們用掃描電子顯微鏡（SEM）來確定細(xì)菌是否仍然附著在葉片和根面上。

圖1實驗裝置的組裝及溫室實驗裝置的研究

MiSeq測序：細(xì)菌測序區(qū)段（V3-V4）； 

研究結(jié)果：

研究植物內(nèi)生細(xì)菌起源的受控環(huán)境建立

為了研究細(xì)菌在葉和根之間的重新定植，我們設(shè)計了一種可以分離植物葉和根隔室的受控環(huán)境裝置（圖1）。每個樣本測93,282±10,823 原始序列，經(jīng)過優(yōu)化過濾后，每個樣本獲得68,187±7860優(yōu)化序列。所有樣品的Coverage均在99%以上。匹配上植物葉綠體或線粒體16S rRNA序列被過濾掉?？諝?/span>/土壤無菌處理（SsAs）組的葉和根內(nèi)生菌在過濾后仍然保留極少數(shù)細(xì)菌OTU，這表明我們的實驗裝置可以提供相對無菌的土壤和空氣環(huán)境。但是空氣/土壤無菌處理（SsAs）組的葉片和根內(nèi)生菌的Shannon多樣性指數(shù)與其它組別有顯著性差異（P＜0.05）。

茅蒼術(shù)葉片和根內(nèi)生菌

采用可分離的無菌實驗裝置檢測茅蒼術(shù)葉和根部隔室中的細(xì)菌轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果表明在SnAs組（僅空氣無菌處理）的葉片或SsAn（僅土壤無菌處理）的根中檢測到細(xì)菌。在我們的研究中，葉片內(nèi)生菌在SnAs組（僅空氣無菌處理）條件下只可能來自根部內(nèi)生菌，根部內(nèi)生菌在SsAn（僅土壤無菌處理）組條件下只可能來自葉片內(nèi)生菌。因此，我們的研究結(jié)果表明，茅蒼術(shù)的葉內(nèi)生菌可以傳遞到根部，根內(nèi)的細(xì)菌也可以被傳送到葉片。

此外，還發(fā)現(xiàn)葉片和根際細(xì)菌在傳遞過程中具有選擇性，SnAs組（僅空氣無菌處理）或SsAn（僅土壤無菌處理）組的葉片和根內(nèi)生菌之間有顯著差異（圖2A，B）。

同時發(fā)現(xiàn)SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）的根內(nèi)生菌聚類在一起，這表明從土壤中獲得的根內(nèi)生菌是相似的（圖2B）。然而SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）的根內(nèi)生菌具有明顯差異（圖2B），這表明SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）的根內(nèi)生菌主要獲得自土壤，SsAn（僅土壤無菌處理）的根內(nèi)生菌主要獲得自葉片，它們顯著不同。

至于葉片內(nèi)生菌，結(jié)果表明，在SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）之間，或在SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）之間的葉片內(nèi)生菌沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。SnAs組（僅空氣無菌處理）或SsAn（僅土壤無菌處理）組的葉片內(nèi)生菌之間有顯著差異，這說明空氣來源和土壤來源的細(xì)菌可能同時影響葉片內(nèi)生菌群的分布。但是SsAn（僅土壤無菌處理）組葉片內(nèi)生菌與SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）葉片內(nèi)生菌非相似度遠(yuǎn)大于0.37（圖2B），這說明土壤來源的細(xì)菌對茅蒼術(shù)葉片內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)有相對較大的影響。

圖2不同處理條件下茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)差異

茅蒼術(shù)細(xì)菌屬與揮發(fā)油成分的異同

我們發(fā)現(xiàn)了茅蒼術(shù)葉和根中的15個優(yōu)勢菌屬（圖3A）。在SnAs組（僅空氣無菌處理）中發(fā)現(xiàn)了一些葉內(nèi)生菌屬，這些葉內(nèi)生菌屬僅可能來自根。同時，在SsAn（僅土壤無菌處理）中也發(fā)現(xiàn)了一些根內(nèi)生菌屬，其中根內(nèi)生菌屬僅可能來自葉。

此外，在不同處理（圖3A）中，葉片和根之間的內(nèi)生細(xì)菌屬也不同：Stenotrophomonas在葉片中的豐度高于根，而在不同處理下，根中的Cupriavidus更為普遍。這說明葉部和根部對于內(nèi)生細(xì)菌具有一定的的選擇性，從而造成不同部位內(nèi)生細(xì)菌的差異。

同時，熱圖分析還揭示了在SnAn、SnAs和SsAn處理中葉或根中的揮發(fā)油具有細(xì)微但顯著的差異：SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）的葉片揮發(fā)性油譜不同于SnAs組（僅空氣無菌處理）。同樣，SnAs組（僅空氣無菌處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）的根揮發(fā)油譜不同于SnAn（土壤/空氣均自然處理）。

在揮發(fā)油譜相似性的RDA分析中，在RDA1軸（圖3B）中，基于它們是來自葉或根，樣本清楚地聚集在一起，不同的植物部位揮發(fā)油不同。然而，在RDA2軸的中，基于來自SnAn, SnAs, SsAn不同處理，樣本清楚地聚集在一起。只有四個優(yōu)勢細(xì)菌屬，Chryseobacterium, Cupriavidus, Flavobacterium, Stenotrophomonas對揮發(fā)油譜也有顯著影響，Cupriavidus和Stenotrophomonas在RDA1軸上的相關(guān)性更大，Chryseobacterium，F(xiàn)lavobacterium在RDA2軸上的相關(guān)性更大，綜上所述，不同來源的細(xì)菌屬可能對茅蒼術(shù)不同組織部位的揮發(fā)油代謝過程產(chǎn)生影響。

圖3  不同處理條件下茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌的差異以及這些菌屬與揮發(fā)油譜的相關(guān)性

研究結(jié)論：

1. 茅蒼術(shù)葉部內(nèi)生菌能夠由空氣中選擇性進(jìn)入，植物根部也可以從土壤中選擇微生物進(jìn)入植物體內(nèi)。葉片和根系的內(nèi)生細(xì)菌大部分來自土壤，然而，空氣來源的細(xì)菌種群也部分參與到根部內(nèi)生細(xì)菌種群的構(gòu)建過程。

2. 不同的植物部位（葉部和根部）對于內(nèi)生細(xì)菌種群具有一定的選擇性，最終造成葉部和根部內(nèi)生菌群的差異。這些特異性選擇的內(nèi)生菌最終對茅蒼術(shù)的揮發(fā)油代謝過程產(chǎn)生影響。