基于下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)痛風(fēng)患者線粒體基因組分析

發(fā)稿時(shí)間：2018-08-29來(lái)源：天昊生物

 

 

 

題目：基于下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)痛風(fēng)患者線粒體基因組分析

發(fā)表期刊：Arthritis Research & Therapy 

發(fā)表時(shí)間：2018-7-6 影響因子：4.269

 

背景

越來(lái)越多的證據(jù)表明，線粒體DNA(mtDNA)等位基因獨(dú)立于核基因組，并且與疾病特別是是人類代謝疾病密切相關(guān)。然而，這一領(lǐng)域的研究與核等位基因的疾病方面相比仍落后很多，例如痛風(fēng)等。

 

研究方法

Illumina Hiseq和Ion Proton平臺(tái)的線粒體基因組測(cè)序

 

研究?jī)?nèi)容及結(jié)果

本研究利用下一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)52名痛風(fēng)男性患者和104名數(shù)據(jù)庫(kù)中的非痛風(fēng)樣本對(duì)照的mtDNA等位基因和表型變異之間的關(guān)系進(jìn)行研究，鑒定了與參考序列(GRCh38)之間的差異。序列核關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(SKAT)用于鑒定線粒體基因中痛風(fēng)關(guān)聯(lián)等位基因。綜合運(yùn)用基因分型、SIFT及預(yù)測(cè)病理突變(PMUT)、人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(mtDB)、多重比對(duì)(MAFFT)和哺乳動(dòng)物線粒體tRNA基因(Mamit-tRNA)分析評(píng)估等位基因的致病性，并利用qPCR SNPs對(duì)潛在致病等位基因進(jìn)行了驗(yàn)證。

 

 

 

圖1、測(cè)序數(shù)據(jù)分析工作流的示意圖。在與參考序列(GRCh38)進(jìn)行比對(duì)后，記錄痛風(fēng)患者和非痛風(fēng)對(duì)照中與參考序列(GRCh38)不同的822個(gè)等位基因(包括：蛋白質(zhì)編碼基因中的376個(gè)同義等位基因和160個(gè)非同義等位基因，tRNA基因中的52個(gè)等位基因，核糖體RNA ( rRNA )基因中的61個(gè)等位基因，以及非編碼區(qū)中的173個(gè)等位基因)。步驟1：痛風(fēng)患者和非痛風(fēng)對(duì)照等位基因富集通過(guò)卡方檢驗(yàn)/Fisher精確檢驗(yàn)來(lái)鑒定。步驟2：計(jì)算基因負(fù)荷比，以將等位基因表征為正相關(guān)等位基因或負(fù)相關(guān)等位基因，用于序列核心關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(SKAT)分析。步驟3：從SKAT分析中獲得了8個(gè)與痛風(fēng)相關(guān)的基因，針對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因中的等位基因進(jìn)行Polyphen、SIFT和PMUT分析，針對(duì)tRNA基因中的等位基因進(jìn)行mtDB、MAFFT和Mamit-tRNA)分析。步驟4：進(jìn)一步驗(yàn)證所選等位基因的基因分型結(jié)果。步驟5：在功能注釋后，選擇蛋白質(zhì)編碼基因中的四個(gè)等位基因和tRNA基因中的四個(gè)等位基因進(jìn)行基因型-表型關(guān)聯(lián)。

 

 

表1、在痛風(fēng)患者與非痛風(fēng)對(duì)照中觀察到的等位基因統(tǒng)計(jì)情況

 

 

 

 

圖2、痛風(fēng)患者tRNA基因中與線粒體正相關(guān)的等位基因。在痛風(fēng)相關(guān)tRNA基因的所有陽(yáng)性關(guān)聯(lián)等位基因中，四個(gè)等位基因(m.5628 T > C，m.5783G > A，m.5814 T > C和m.15894G > A)破壞了堿基配對(duì)原則，被認(rèn)為是潛在的致病等位基因。核苷酸之間的三級(jí)相互作用用虛線表示。箭頭指示tRNA突變的位置。紅色為潛在致病等位基因，綠色為非致病等位基因。

 

表2、SKAT分析鑒定的MT-CO3中正相關(guān)的等位基因

 

 

 

 

 

圖3、用qPCR SNPs方法對(duì)m.5628 T > C 和m.9957 T > C的驗(yàn)證結(jié)果。

 

研究結(jié)論

本研究在痛風(fēng)患者中鑒定了456個(gè)等位基因，在非痛風(fēng)對(duì)照中鑒定了640個(gè)等位基因，兩者共有274個(gè)等位基因。線粒體基因與痛風(fēng)相關(guān)的基因中，MT-CO3、MT-TA、MT-TC和MT-TT含有可能致病的痛風(fēng)相關(guān)等位基因，驗(yàn)證試驗(yàn)也證實(shí)了選定的等位基因的測(cè)序結(jié)果。通過(guò)基因型-表型關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，MT-CO3潛在致病等位基因與高密度脂蛋白(HDL)水平相關(guān)。

 

本研究提供了與痛風(fēng)相關(guān)的最詳細(xì)的線粒體基因組圖譜結(jié)果。本研究結(jié)果證實(shí)了線粒體基因差異在痛風(fēng)和高密度脂蛋白中的作用，這一實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)框架為其他涉及線粒體功能障礙的疾病研究提供參考。

 

 

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