mbio：人類腸道菌群組成和功能差異與傷寒沙門氏菌感染臨床結(jié)局相關(guān)

發(fā)稿時間：2018-09-04來源：天昊生物

 英文題目: Compositional and Functional Differences in the Human Gut Microbiome Correlate with Clinical Outcome following Infection with Wild-Type Salmonella enterica Serovar Typhi

中文題目：人類腸道微生物組成和功能差異與傷寒沙門氏菌感染臨床結(jié)局的關(guān)系

期刊名：mbio 

影響因子： 6.689

發(fā)表時間：2018年6月

研究背景: 

傷寒沙門氏菌(S.Typhi) 是一種人體限制性腸道病原體，每年導致11.9至2690萬人患傷寒。Ty21a是減毒口服疫苗，是預防傷寒的兩種廣泛使用的疫苗之一。在先前的研究中，我們研究了接受Ty21a疫苗的志愿者腸道微生物群與傷寒桿菌特異性免疫應(yīng)答之間的關(guān)系。人類攻擊模型的發(fā)展為我們提供了獨特的機會，以解析免疫接種和隨后暴露于傷寒沙門氏菌后腸道微生物群的組成和功能，并進一步研究粘膜免疫應(yīng)答與腸道微生物群是否有關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，微生物群的組成可能與免疫原性和口服疫苗效力有關(guān)。例如，生活在資源有限環(huán)境中的兒童小腸中細菌的過度生長可能導致口服霍亂弧菌減毒活疫苗CVD 103-HgR抗體效價低。此外，其它疫苗，包括輪狀病毒和口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，在資源有限的地區(qū)其疫苗效力和免疫原性也降低。通過這些研究，可最終用于提高口服疫苗對傷寒和其它腸道感染的保護作用。

研究對象：

為了研究兩種傷寒沙門氏菌口服減毒活疫苗（Ty21a疫苗或疫苗M01ZH09）免疫效果和隨后暴露于野生型傷寒沙門氏菌對腸道微生物群組成與功能的影響。我們在英國牛津大學進行的一項研究中，對30名健康成人試驗受試者的糞便樣品進行了縱向16S rRNA基因和宏轉(zhuǎn)錄分析，這些受試者被隨機分成三組。這些志愿者是健康男性或未懷孕女性，年齡在18-60歲之間，沒有傷寒疫苗接種史或傷寒沙門氏菌感染史。

志愿者接受Ty21a(一種減毒傷寒活疫苗)、M01ZH09(一種減毒活傷寒疫苗候選株)或安慰劑，28天后用野生型傷寒沙門氏菌進行攻擊暴露，然后監(jiān)測臨床癥狀與血液生化反應(yīng)。在篩選面試（基線1）、首次免疫接種前（基線2）、接種安慰劑和M01ZH09后兩個時間點（28天和26天）、接種Ty21a后兩個時間點（32天, 30天, 28天, 26天）、傷寒沙門氏菌攻擊之前(第0天)、攻擊后5個時間點（12小時、1天、3天、7天和10天）收集糞便樣本。

技術(shù)平臺：細菌16S測序區(qū)段（V3-V4）；RNA-seq 

研究結(jié)果：

微生物群落組成分析

• 16S rRNA基因數(shù)據(jù)分組為三個聚類：(i)高豐度的糞桿菌 (圖1A，綠色垂直條)，(ii) 高豐度的糞桿菌和擬桿菌(圖1A，紅色垂直條)， (iii) 高豐度的厚壁菌（圖1A，藍色垂直條）。
• 以糞桿菌為主的簇（綠色）的微生物多樣性顯著低于其他兩個（圖1B）。而發(fā)展成傷寒組（TD）和沒有發(fā)展成傷寒組（NTD）的受試者之間沒有觀察到顯著差異（圖1C）。
• 安慰劑受試者主要以糞桿菌屬和厚壁菌屬為優(yōu)勢菌，Ty21a受試者主要以糞桿菌屬和擬桿菌屬為優(yōu)勢菌，M01ZH09受試者主要以厚壁菌屬為優(yōu)勢菌（圖1C）。
• 利用Spearman’s相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬和普雷沃菌屬是負相關(guān)，甲烷桿菌屬與Akkermansia, Parabacteroides, Ruminococcus, Coprococcus, Oscillospira是正相關(guān)，與Faecalibacterium和Roseburia負相關(guān)（圖1D）。

 

圖1縱向樣品微生物組成分析

 宏轉(zhuǎn)錄組進行微生物群落分類學分析

• 每個糞便樣本的宏轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生50.4 百萬條reads。宏轉(zhuǎn)錄組分析鑒定到兩個聚類：(i)高豐度的甲烷桿菌轉(zhuǎn)錄物 (圖2A)；(ii) 多種厚壁菌屬。這個結(jié)果得到PCA分析的支持，PCA分析證實了兩個主要聚類以甲烷桿菌轉(zhuǎn)錄本的豐度為區(qū)別特征（圖2E）。
•  以甲烷桿菌為主簇的微生物多樣性與多種厚壁菌屬有顯著差異（圖2B）。而發(fā)展成傷寒組（TD）和沒有發(fā)展成傷寒組（NTD）的受試者之間沒有觀察到顯著差異（圖2C）。
• 利用Spearman’s相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)甲烷桿菌屬和多樣性菌屬呈強烈負相關(guān)，包括Eubacterium, Faecalibacterium , Ruminococcus, Blautia, Roseburia,Bacteroides（圖2D）。擬桿菌屬和普雷沃菌屬是負相關(guān)，這與16S rRNA測序結(jié)果類似。
• 我們評估了16S rRNA基因數(shù)據(jù)與宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間的總體相關(guān)性，然而沒有觀察到顯著的關(guān)系。

 

圖2縱向樣品宏轉(zhuǎn)錄組分析

• 對宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的時間縱向分析表明，無論是接種疫苗期間或暴露于傷寒沙門氏菌后，個體的微生物組成都相對穩(wěn)定(圖3A和B)。在時間縱向分析中甲烷桿菌為主的群落似乎比多種厚壁菌屬為主的群落更穩(wěn)定（圖3C）。

 

圖3縱向樣品的微生物組成穩(wěn)定性分析

不同類型轉(zhuǎn)錄組群落之間的功能差異

• 2種類型轉(zhuǎn)錄組群落之間的功能差異隨著時間表現(xiàn)出持續(xù)的顯著差異（圖4）:產(chǎn)甲烷菌群落中的基因主要參與甲烷生成、細胞對輻射的響應(yīng)、二價無機陽離子穩(wěn)態(tài)、原卟啉原IX生物合成、單碳代謝和翻譯后蛋白修飾（圖4D）。多種厚壁菌屬的基因主要參與參與鞭毛組裝、鞭毛依賴性細胞運動、細胞孢子形成、單糖運輸、甘露糖代謝和纖維素分解代謝。

圖4不同類型轉(zhuǎn)錄組群落之間的功能差異

與疫苗接種相關(guān)的差異表達基因

• 在安慰劑治前后，腸道微生物組的整體基因表達譜沒有變化。
• 接受傷寒沙門氏菌口服減毒活疫苗Ty21a的志愿者在免疫前后差異表達的基因相對較少(免疫后4個基因下調(diào)，4個基因上調(diào))。這些發(fā)現(xiàn)與之前的報告一致，Ty21a的免疫對腸道微生物群的影響很小。
• 相反，在接受M01ZH09疫苗前后，72個基因發(fā)生差異表達，29種產(chǎn)甲烷相關(guān)基因在治療中上調(diào)，雖然這種差異可能與疫苗接種有關(guān)，但這些差異表達基因更可能反映這些樣本的微生物組成隨時間發(fā)生變化。  

菌群類型與臨床結(jié)局的關(guān)系

• 我們觀察到野生型傷寒沙門氏菌攻擊后的臨床結(jié)果（TD與沒有TD）存在差異，而這種差異與轉(zhuǎn)錄組群落類型相關(guān)。60%的含有較高豐度甲烷桿菌轉(zhuǎn)錄物的志愿者在暴露于傷寒沙門氏菌后沒有出現(xiàn)TD癥狀。相比之下，65%的含有較低豐度甲烷桿菌轉(zhuǎn)錄物的志愿者在暴露于傷寒沙門氏菌后表現(xiàn)出與TD一致的臨床癥狀。為了評估臨床結(jié)局是否均勻地分布于這2個轉(zhuǎn)錄組群落類型中（甲烷桿菌屬和多樣性菌屬），進行了卡方檢驗，結(jié)果表明腸道菌群類型與患TD的風險有關(guān)。
• 將混合效應(yīng)回歸模型應(yīng)用于縱向數(shù)據(jù)，以評估發(fā)展或沒有發(fā)展為TD的受試者在不同時間點(基線、疫苗后和暴露于傷寒沙門氏菌后)每個菌群的平均相對豐度，并比較兩組在每個時間點的差異是否顯著（表1）。這一分析揭示了高豐度的甲烷桿菌與暴露后不患傷寒疾病顯著相關(guān)。相比之下，發(fā)展成TD的受試者在基基線、疫苗后和暴露后Eubacterium真細菌屬的相對豐度顯著較高，表明Eubacterium和TD之間存在關(guān)系。

 

表1不同時間點菌屬平均相對豐度

與臨床結(jié)果相關(guān)的菌群特異性基因表達

• 使用KEGG直系圖，我們評估了TD和非TD患者在兩個基線樣本、傷寒沙門氏菌攻擊后1天（D1）或1周（D7）采集樣本中的差異表達基因（圖5）。
• 觀察到一些與氧化應(yīng)激相關(guān)的酶在非TD患者所有時間點都以較高水平表達。在非TD患者中，Barnesiella菌中超氧化物歧化酶（K04564）、Bacteroides菌中過氧化氫酶（K03781）和含錳過氧化氫酶（K07217）在基線水平有較高水平的表達。后者與類桿菌的谷胱甘肽過氧化物酶（K00432）一起在暴露后1天的非TD患者中也以較高水平表達。
• 編碼鐵硫結(jié)合酶（K00196和K14127）的基因在暴露后1天的非TD患者中以較高水平表達（圖5）。其他含鐵硫酶的基因，包括丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（K00 169-K00172)和2-氧戊二酸酯(K00187和K00189)作為底物，在暴露后1天的非TD患者中也以較高水平表達。
• 在Bacteroides (K06079)和Blautia (K06201)中，編碼銅穩(wěn)態(tài)蛋白的基因在非TD患者基線期中表達水平較高。Streptococcus的鐵/鋅/銅轉(zhuǎn)運系統(tǒng)ATD結(jié)合蛋白(K11706) 在非TD患者基線期中表達水平較高。銅伴侶（K07213）在暴露后1天的非TD患者中也以較高水平表達。
• 熱休克蛋白HspR基因?qū)儆?/span>MerR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（K13640），在暴露后1天的非TD患者中也以較高水平表達。
• 比較來自非TD志愿者和TD患者的宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)非TD患者中幾個應(yīng)激反應(yīng)基因的表達水平更高，包括來自多個屬的伴侶蛋白GroEL（K04077）和GroES（K04078）。此外，編碼多重應(yīng)激抵抗蛋白BhsA(K12151)和熱休克蛋白(K03283和13640)的基因在暴露后1天的非TD患者中也以較高水平表達。

 

圖5 在基線（BL）、暴露1天后（Post-chall 1D）或暴露7天后（Post-chall 7D），非TD和TD受試者在基因表達上的顯著差異◆

研究結(jié)論：

1. 在本研究中，我們利用人類攻擊模型中解析了人類攻擊模型接種疫苗和隨后暴露于野生型傷寒沙門氏菌不同時間的腸道微生物群組成(16S rRNA測序)和功能(RNA測序)，用來驗證臨床結(jié)果可能與腸道微生物群有關(guān)的假說。

2. 從研究對象收集的縱向糞便樣本的宏轉(zhuǎn)錄組分析表明，人腸道微生物群有兩種穩(wěn)定的基因表達模式，主要是高豐度的甲烷桿菌轉(zhuǎn)錄物和多種厚壁菌屬轉(zhuǎn)錄物。

3. 接受傷寒沙門氏菌口服減毒活疫苗Ty21a在免疫前后對腸道微生物組成或功能影響最小。

4. 在野生型傷寒沙門氏菌攻擊后，甲烷桿菌占優(yōu)勢的轉(zhuǎn)錄組菌群在基線期顯示出較低的傷寒癥狀發(fā)生風險。

5. 編碼抗氧化蛋白、金屬穩(wěn)態(tài)和運輸?shù)鞍滓约盁嵝菘说鞍椎幕蛟诨€期或傷寒沙門氏菌攻擊后無傷寒癥狀的受試者中存在較高表達水平。

6. 這些數(shù)據(jù)表明，腸道微生物群中的與氧化還原電位和離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)的功能差異可能影響野生型傷寒沙門氏菌暴露后的臨床最終結(jié)果。