1.技術(shù)簡介：
16S rRNA基因擴增子高通量測序，是通過對基因組目的區(qū)域進(jìn)行PCR擴增，將目標(biāo)區(qū)域DNA擴增富集后進(jìn)行高通量測序的研究策略，可有效研究特定環(huán)境中的物種信息，檢測幾十至幾百種微生物特性。近來，特定環(huán)境樣本中某一類群微生物的絕對定量問題受到越來越多研究學(xué)者的關(guān)注，以往都是通過特定物種的qPCR絕對定量進(jìn)行檢測，但qPCR定量實驗結(jié)果常常不穩(wěn)定，且特定物種qPCR需要設(shè)計特定引物，對引物特異性要求較高，且引物優(yōu)化難度較大，導(dǎo)致常規(guī)的qPCR絕對定量實驗不再適用于組成較為復(fù)雜的環(huán)境樣本微生物絕對定量。目前，16S rRNA基因測序手段通過某一OTU分類單元的序列數(shù)占總序列數(shù)的比值來獲得相對豐度數(shù)據(jù)，然而相對豐度信息不能反映環(huán)境樣本中物種絕對豐度情況，而基于16S spike-in standards的微生物絕對定量測序恰好能夠獲得環(huán)境樣本中物種的絕對豐度數(shù)據(jù)。
該方法通過向樣品DNA中添加一定量spike-in standards人工合 成序列，進(jìn)行16S擴增子文庫構(gòu)建、測序，再根據(jù)spike-in standards 的16S擴增子reads數(shù)及其絕對拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中OTU代表序列對應(yīng)物種16S rRNA基因絕對拷貝數(shù)。添加16S spike-in standards到樣品模板中進(jìn)行16S rRNA基因擴增子高通量測序較好的解決了環(huán)境樣本中微生物的絕對定量問題，同時也能得到環(huán)境樣本中的物種組成信息。
說明：由于該方法需要額外添加外源核算序列，且對樣本的DNA要求也較高，因此目前階段只適合做一些常規(guī)的環(huán)境樣本 (常規(guī)土壤樣本，人糞便樣本)。
2.技術(shù)優(yōu)勢
3．應(yīng)用領(lǐng)域
4.技術(shù)參數(shù)
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測序類型 |
推薦區(qū)域 |
樣品要求 |
測序策略 |
數(shù)據(jù)要求 |
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微生物16S擴增子絕對定量測序 |
V3 V4 V3+V4 V4+V5 |
樣品類型：常規(guī)土壤樣本和人糞便DNA，無明顯降解； 樣品需求量：總量>500ng；濃度≥20ng/μL； 純度：OD260/280=1.7-2.0。 |
Illumina 2×250 Illumina 2×150 |
每個樣本有效序列≥15萬條，spike-in序列占總序列10%~50%；Raw data Q30數(shù)據(jù)達(dá)到70%以上，Clean data Q30數(shù)據(jù)達(dá)到80%以上。 |
5.技術(shù)路線
6.分析內(nèi)容
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標(biāo)準(zhǔn)分析 |
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數(shù)據(jù)統(tǒng)計與優(yōu)化 |
OTU分類分析 |
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原始序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計 |
優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計 |
OTU聚類分析 |
分類學(xué)分析 |
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物種注釋統(tǒng)計 |
進(jìn)化樹分析 |
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OTU絕對定量 |
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樣本OTU Id對應(yīng)的物種絕對拷貝數(shù)統(tǒng)計 |
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群落組成分析 |
Alpha多樣性分析 |
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單樣本物種組成餅圖 |
單樣本多級物種組成圖 |
多樣性指數(shù)分析 |
多樣性指數(shù)差異分析 |
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分類學(xué)系統(tǒng)組成樹 |
物種總豐度柱狀圖 |
稀釋性曲線 |
Shannon-Wiener曲線 |
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豐度分布Bubble圖 |
多樣本群落結(jié)構(gòu)柱狀圖 |
Rank-Abundance曲線 |
物種累積曲線 |
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樣本聚類樹柱狀圖 |
Heatmap熱圖 |
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Metastats分析 |
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Beta多樣性分析 |
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Venn圖分析 |
樣本聚類樹圖 |
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PCA分析 |
PCoA分析 |
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NMDS分析 |
ADONIS分析 |
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Lefse分析 |
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高級分析項目 |
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環(huán)境因子分析 |
可選分析 |
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Mantel test分析 |
Bioenv分析 |
PD分析 |
3D-PCoA分析 |
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物種與環(huán)境因子相關(guān)性分析 |
RDA/CCA分析 |
PLS-DA分析 |
ANOSIM分析 |
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Metagenomeseq分析 |
Wilcoxon秩和檢驗/ANOVA分析 |
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PICRUSt功能分析 |
優(yōu)勢物種網(wǎng)絡(luò)圖分析 |
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Indicator分析 |
OTU富集三元相圖 |
7.服務(wù)流程
8. 結(jié)果展示
1) 樣本OTU代表序列對應(yīng)物種16S rRNA基因絕對拷貝數(shù)計算
a) 16S V4區(qū)擴增子測序的DNA模板中樣品DNA和spike-in DNA添加情況
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模板編號 |
模板中spike-in 拷貝數(shù) |
模板中樣本DNA量 |
樣本信息 |
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Y1_V4 |
2.67E+07 copies |
5 ng |
糞便樣本 |
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Y3_V4 |
2.67E+06copies |
5 ng |
土壤樣本 |
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Y4_V4 |
2.67E+07 copies |
5 ng |
淤泥樣本A |
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Y7_V4 |
2.67E+06copies |
5 ng |
土壤樣本 |
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Y42_V4 |
2.67E+06copies |
5 ng |
淤泥樣本A |
注： Y4_V4和Y42_V4是同一個樣本分別添加2.67E+07 copies和2.67E+06 copies的spike-in DNA后的混合樣本。
b) 根據(jù)spike-in序列制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（以Y4為例），計算優(yōu)勢OTU代表序列物種起始拷貝數(shù)：
表 1 Y4_V4 樣品中spike-in序列數(shù)及拷貝數(shù)
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spike-in序列編號 |
spike-in序列數(shù) （OTUreads） |
spike-in 拷貝數(shù) （copies） |
spike-in序列數(shù)取log log（OTUreads） |
spike-in 拷貝數(shù)取log log（copies） |
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spike_1 |
68841 |
1.20E+07 |
4.837847 |
7.079061 |
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spike_2 |
55078 |
1.20E+07 |
4.740978 |
7.079061 |
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spike_3 |
9155 |
1.20E+06 |
3.961658 |
6.079061 |
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spike_4 |
7949 |
1.20E+06 |
3.900312 |
6.079061 |
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spike_5 |
1085 |
1.20E+05 |
3.03543 |
5.079061 |
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spike_6 |
1034 |
1.20E+05 |
3.014521 |
5.079061 |
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spike_7 |
72 |
1.20E+04 |
1.857332 |
4.079061 |
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spike_8 |
66 |
1.20E+04 |
1.819544 |
4.079061 |
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spike_9 |
66 |
1.20E+04 |
1.819544 |
4.079061 |
c) 以log（copies）為橫坐標(biāo)，log（reads）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：
圖 1 Y4樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線
d) 標(biāo)準(zhǔn)曲線如下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的測試樣品中優(yōu)勢OTU序列(Top10)的起始拷貝數(shù)：
表2 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的測試樣品中優(yōu)勢OTU序列(Top10)的起始拷貝數(shù)
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#OTU ID |
Y4_V4 OTUreads |
Y4_V4 copies |
Y4_V4 log（OTUreads） |
Y4_V4 log（copies） |
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OTU60 |
47754 |
7.72E+06 |
4.67901 |
6.887707 |
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OTU8 |
6052 |
9.55E+05 |
3.781899 |
5.980068 |
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OTU73 |
3820 |
6.00E+05 |
3.582063 |
5.777887 |
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OTU63 |
3650 |
5.73E+05 |
3.562293 |
5.757884 |
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OTU72 |
3028 |
4.74E+05 |
3.481156 |
5.675795 |
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OTU71 |
3017 |
4.72E+05 |
3.479575 |
核心產(chǎn)品聯(lián)系方式
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