1+1大于2 ! 微生物16S擴增子絕對定量測序檢測新模式創(chuàng)雙贏

發(fā)稿時間：2018-09-30來源：天昊生物

 

目前的細菌群落研究方法有：磷脂脂肪酸分析技術、高通量測序技術等，而細菌定量法有：氯仿熏蒸生物量碳氮測定法、染色-熒光顯微鏡計數法、平板培養(yǎng)計數法、實時熒光定量PCR法等。目前微生態(tài)研究論文中常常同時使用以上多項技術，例如最常用的就是qPCR絕對定量檢測細菌總拷貝數和常規(guī)微生物16S擴增子測序檢測細菌菌群結構的聯合使用了。實際上如何將細菌群落結構和細菌絕對定量有機結合起來從而同時獲得細菌群落結構和細菌菌種絕對拷貝數是目前微生物研究領域的一個技術趨勢，同時對微生態(tài)的分析工作具有重大意義，今天小編就向大家介紹微生態(tài)研究最常用的幾項技術，其中既有目前市場上最常用的兩項技術，又有一項我們天昊自主研發(fā)的“1+1大于2” 檢測新技術，那下面就看看哪個才是適合不同微生態(tài)研究目的那個它。

Number1

qPCR絕對定量檢測

 

涉及技術：qPCR絕對定量

原理：

• 構建標準曲線，將已知拷貝數的標準品梯度進行稀釋，一般可以10倍稀釋5-7個梯度，進行qPCR檢測， Ct值與樣品中起始模板拷貝數的對數呈線性反比關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線；
• 對樣品進行目的基因（例如細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)）qPCR檢測，根據標準曲線計算樣品中物種的絕對拷貝數。

優(yōu)點：

• 個性化強，針對目標菌種設計特異性引物進行絕對定量檢測

局限性：

• 對引物特異性要求較高，引物優(yōu)化難度較大（見下圖）

 

Number2

常規(guī)微生物16S擴增子測序

 

涉及技術： 基因組目的區(qū)域PCR+二代測序；

原理：通過對基因組目的區(qū)域（細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)）進行PCR擴增，將目標區(qū)域DNA擴增富集后進行高通量二代測序，然后將得到的序列與特定數據庫比對，確認物種，將16S rDNA 序列相似性高于97% 的不同序列定義為一個OTU，即每個OTU對應于一個不同的 16S rDNA 序列，然后通過計算某一OTU分類單元的序列數占總序列數的比值來獲得物種相對豐度數據。通過OUT聚類分析，就可以知道樣品中的微生物結構組成和不同微生物的相對豐度。

優(yōu)點：

• 高通量測序，大數據量、低花費
• 客觀還原菌群結構及相對豐度比例

局限性：

• 只能進行物種相對定量檢測，不能反映物種絕對豐度情況（見下圖）

 

   

Number3

微生物16S擴增子絕對定量測序

 

涉及技術：（樣本基因組目的區(qū)域PCR+ spike-in standards目的區(qū)域PCR）+二代測序；

原理：該方法通過向樣品DNA中添加一定量spike-in standards人工合成序列，進行16S擴增子文庫構建、測序，再根據spike-in standards的16S擴增子reads數及其絕對拷貝數繪制標準曲線，計算出樣品中OTU代表序列對應物種16S rRNA基因絕對拷貝數。添加16S spike-in standards到樣品模板中進行16S rRNA基因擴增子高通量測序較好的解決了樣本中微生物的絕對定量問題，同時也能得到樣本中的物種組成信息。

優(yōu)點：

•  三合一: 常規(guī)微生物16S擴增子測序+總細菌絕對定量+特定菌種絕對定量
•  解析樣本中總細菌的絕對拷貝數
• 解析樣本中絕大多數優(yōu)勢物種的絕對拷貝數
• 同時客觀還原樣本菌群結構

 

局限性：

• 測序數據量高于常規(guī)微生物16S擴增子測序，成本有所增加
•  目前階段只適合常規(guī)樣本檢測，例如土壤樣本和糞便樣本

 

微生物16S擴增子絕對定量測序新檢測模式發(fā)揮“細菌群落結構+ 細菌絕對定量”兩種檢測技術的各自優(yōu)勢，變‘兩張皮’為‘一盤棋’，最大限度地便利了微生態(tài)研究者的便利。

 

想了解更多“微生物16S擴增子絕對定量測序”內容，請點擊鏈接：

【新品速遞】天昊生物推出微生物16S擴增子絕對定量測序服務