【昊閱讀】SSR-seq：與傳統(tǒng)方法相比，利用下一代測(cè)序進(jìn)行SSR基因分型可以獲得更高水平多態(tài)性

發(fā)稿時(shí)間：2018-12-21來源：天昊生物

就在天昊生物自主研發(fā)的基于illumina高通量測(cè)序平臺(tái)的--SSRseq^TM產(chǎn)品線上市近兩年，多項(xiàng)科研服務(wù)項(xiàng)目順利完成之際，德國(guó)和奧地利研究人員的類似方法報(bào)道才“姍姍來遲”，成功發(fā)表在10月25日Ecology and Evolution雜志上。這不僅從側(cè)面反映了天昊生物SSRseq^TM技術(shù)的可行性與前瞻性，也再次印證了我們敢為人先、堅(jiān)持創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展的一貫理念。下面就讓我們來仔細(xì)看一下這篇文章的研究?jī)?nèi)容。

本研究提出了一個(gè)SSR-seq的名詞（我們的命名為SSRseq^TM），認(rèn)為與傳統(tǒng)的僅僅依靠片段大小來進(jìn)行評(píng)分和基因分型的方法相比，利用下一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行SSR基因分型，可以獲得更高水平基因多態(tài)性結(jié)果。

摘要速覽

 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR，或稱微衛(wèi)星、STR)是群體遺傳學(xué)中廣泛使用的一種分子標(biāo)記。目前，對(duì)其基因分型的檢測(cè)仍然主要依靠片段長(zhǎng)度進(jìn)行。隨著下一代測(cè)序(NGS)的發(fā)展，研究者獲得感興趣基因座的序列信息變得更加容易，依靠測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR基因型檢測(cè)，避免因?yàn)槠未笮〗贫a(chǎn)生的錯(cuò)誤判讀。本研究描述了一種NGS研究策略，該策略可以對(duì)感興趣的SSR位點(diǎn)進(jìn)行定制化檢測(cè)，一次性完成對(duì)數(shù)百個(gè)個(gè)體的基因型分析，將多重PCR、條形碼和illumina測(cè)序相結(jié)合。本研究創(chuàng)建了三個(gè)不同的數(shù)據(jù)集，根據(jù)(a)重復(fù)區(qū)域的長(zhǎng)度、(b)總片段長(zhǎng)度和(c)序列一致性對(duì)等位基因進(jìn)行解析，用來評(píng)估與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的差別，計(jì)算遺傳多樣性及F_ST和R_ST值。通過下一代測(cè)序獲得的信息提供了比傳統(tǒng)SSR基因分型更好的分辨率，并允許更精確的進(jìn)化解釋。

本研究利用三種被子植物：Donatia fascicularis (柱花草科)、Mulguraea tridens (馬鞭草科)和Oreobolus obtusangulus (莎草科)，總共對(duì)859個(gè)個(gè)體的58個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析。

表1、研究物種列表

利用illumina MiSeq2000平臺(tái)paired-end模式測(cè)序。預(yù)定義的重復(fù)單位長(zhǎng)度為3-6個(gè)堿基，微衛(wèi)星區(qū)域的最小長(zhǎng)度為21 bp。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，其中一個(gè)引物總是被選擇靠近SSR，以確保在SSR分析期間，單個(gè)read包含整個(gè)重復(fù)區(qū)域，從而確保配對(duì)reads的正確合并，目標(biāo)長(zhǎng)度可達(dá)450 bp。

圖1、實(shí)驗(yàn)流程圖

(a)引物條形碼：物種A的n×96個(gè)個(gè)體在20個(gè)基因座上進(jìn)行基因分型，n：條形碼引物組數(shù)；(b)多組別多重PCR；(c) SSR擴(kuò)增子混合建庫

表2、每個(gè)位點(diǎn)片段大小的非同源相似性

備注：非同源相似性（Homoplasy）定義為包含未檢出的隱藏變異的片段大小(即長(zhǎng)度相同但序列不同的等位基因)的數(shù)量除以片段大小的總數(shù)

序列數(shù)據(jù)顯示片段大小的非同源相似性現(xiàn)象非常普遍(表2)。物種之間的差異(所有基因座的平均值為44.7% - 63.5%)，以及一個(gè)物種內(nèi)的基因座之間的差異從20%到100%不等，這是因?yàn)槠未笮☆悇e的數(shù)量與序列變異性與大小類別總數(shù)的比率不同。對(duì)于側(cè)翼區(qū)域，SNP變異比Indel變異更普遍，許多SSR基因座也包含突變的SSR基序(表3)。

表3、位點(diǎn)檢測(cè)信息

備注：SSR motif為SSR基序的序列，數(shù)字表示基序重復(fù)的次數(shù)。Variable sites包括SSR區(qū)域本身和側(cè)翼區(qū)域的序列變異加上重復(fù)基序數(shù)量的變異。N分別表示Variable sites、SNPs和indes的數(shù)量

利用SSR-seq方法，研究者還可以統(tǒng)計(jì)了等位基因總數(shù)和稀有等位基因數(shù)目（表4）。

表4、基于SSR長(zhǎng)度、片段長(zhǎng)度(Fr length)和序列一致性(Seq identity)的三個(gè)不同數(shù)據(jù)集的等位基因總數(shù)和稀有等位基因數(shù)目(在各自的數(shù)據(jù)集中僅出現(xiàn)一次)

表5、基于SSR長(zhǎng)度、片段長(zhǎng)度(Fr length)和序列一致性(Seq identity)的三個(gè)不同數(shù)據(jù)集的遺傳多樣性指數(shù)

備注：He是根據(jù)樣本量修正的基因多樣性。Ho是觀察雜合度。

通過表4和表5看出，三種數(shù)據(jù)集等位基因N_A、He和Ho不盡相同。雖然SSR長(zhǎng)度和片段長(zhǎng)度數(shù)據(jù)集的結(jié)果較為相似，但在所有三種物種中，序列一致性數(shù)據(jù)集的遺傳多樣性估計(jì)值普遍較高。大多數(shù)位點(diǎn)F_ST的結(jié)果較為相近，但是也有部分位點(diǎn)也存在顯著差異。而平均置換R_ST值也在不同物種間存在差異。

可以看出，序列一致性數(shù)據(jù)集在等位基因上的更高分辨率顯而易見，其本身在基因座之間也是高度可變的。也就是說，三個(gè)物種通過序列數(shù)據(jù)集計(jì)算的等位基因數(shù)量分別是從SSR長(zhǎng)度數(shù)據(jù)集計(jì)算的等位基因數(shù)量的1.2 - 8.0倍、1.3 - 13倍和1.6 - 4.0倍。

本研究最終結(jié)論認(rèn)為，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，增加的序列信息有助于更好地理解SSR變異過程。本研究結(jié)果很好的證明了，與傳統(tǒng)的僅僅依靠片段大小來進(jìn)行評(píng)分和基因分型的方法相比，利用下一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行SSR基因分型，可以獲得更高水平基因多態(tài)性結(jié)果。SSR基因座測(cè)序是一種前瞻性方法，能夠檢測(cè)物種內(nèi)和物種間的變異，適用于大規(guī)模和精細(xì)規(guī)模系統(tǒng)地理學(xué)研究。

關(guān)于天昊：

天昊生物長(zhǎng)期從事基因及遺傳分析，可以提供包括SSR檢測(cè)在內(nèi)的多項(xiàng)基因檢測(cè)服務(wù)。天昊生物自主研發(fā)的基于二代測(cè)序技術(shù)的SSR檢測(cè)新方法--SSRseq^TM，這種方法幾乎克服了現(xiàn)存所有電泳檢測(cè)方法的不足，尤其適合對(duì)多SSR位點(diǎn)、超高深度的分型，準(zhǔn)確度高，并且分辨率達(dá)到單堿基的水平。因此適合所有二倍體人類、動(dòng)植物、真核微生物，以及多倍體物種的SSR基因型分析。歡迎聯(lián)系我們具體咨詢！郵箱：techsupport@geneskies.com 電話：400-065-6886