【昊閱讀】人類基因組調(diào)控元件到底調(diào)控了誰？最新的CELL文章給出研究方案

發(fā)稿時間：2019-01-14來源：天昊生物

2019年1月3日，最新的CELL文章結(jié)合了最前沿的兩個技術(shù)-- CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)和單細胞測序技術(shù)，探究了基因組調(diào)控元件與其真正的靶基因關(guān)系配對。隨著基因組研究技術(shù)的不斷發(fā)展，相信研究者會解開更多的基因組未知信息。今天，小編就和大家一起看看這篇文章是怎么樣的一種研究方案。

英文題目：A Genome-wide Framework for Mapping Gene Regulation via Cellular Genetic Screens

中文題目：通過細胞遺傳篩選定位基因調(diào)控的基因組框架

發(fā)表期刊：Cell

影響因子：31.4

敲重點：
? 擾亂了5,920個人類候選增強子對基因表達的影響

? 每個單細胞轉(zhuǎn)錄組含有約28個多重 CRISPRi擾動

? 提升eQTL分析框架，確定了664個順式人類增強子-基因?qū)?

? 確定與這些增強子-基因?qū)ο嚓P(guān)的基因組特征

圖： 摘要圖片版

研究背景

?  人類基因組中已鑒定了超過一百萬個候選調(diào)控元件，但幾乎所有元件都未經(jīng)驗證且其靶基因也是不確定的。

?  確定每個候選原件是否真正起作用，如何起作用，以及確定每個遺傳關(guān)聯(lián)的真正功能性變異，將需要基于大量基因組序列的功能研究。

研究方法

?  作者提出了一個多重的表達數(shù)量性狀基因座（eQTL）-增強子-基因?qū)Φ目蚣?，研究方法是通過在每個細胞引入CRISPR / Cas9介導(dǎo)的擾動的隨機組合，然后進行單細胞RNA測序（RNA-seq）。

圖：多重增強子-基因?qū)Y選方法

l  預(yù)實驗確定研究方案可靠性—針對K562細胞中的1,119個候選增強子進行多重增強子 - 基因?qū)Y選測試

A：基于增強子相關(guān)特征選擇1,119個候選增強子，每個設(shè)計兩個特異性靶向gRNA

B：

（i）將gRNA克隆到慢病毒載體中，并以高感染復(fù)數(shù)遞送至K562細胞。 （ⅱ）對這些細胞進行單細胞RNA-seq，同時捕獲每個細胞中存在的多個gRNA。 

（iii）對于每個候選增強子，根據(jù)是否包含靶向它的gRNA進行細胞分組。 （iv）對于每個這樣的細胞分組，我們測試了兩者之間候選增強子1 Mb范圍內(nèi)基因的群體表達差異

l  升級試驗--作者使用dCas9-KRAB干擾了5,920個候選增強子（對其靶基因沒有強烈的先驗假設(shè)），通過分析254,974個單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定干擾效果。

研究結(jié)果

l  預(yù)實驗結(jié)果：（圖C）將gRNA以高感染復(fù)數(shù)遞送至K562細胞，每個細胞鑒定中值為15±11.3個gRNA。 （圖D）產(chǎn)生總共47,650個單細胞轉(zhuǎn)錄譜。每個擾動的中位數(shù)為516±177個細胞。 （圖E）差異表達測試的分位數(shù) - 分位數(shù)圖。（圖F）靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)（頂行）和b-珠蛋白LCR陽性對照（底行）的表達。被gRNA靶向干擾的基因與NTC（未靶向?qū)φ眨┫啾?，表達差異顯著。

l  升級試驗結(jié)果：（圖A）對于升級試驗，設(shè)計gRNA以靶向總共5,779個候選增強子。（圖B）從K562 DHS中選取948個探索性候選增強子。對預(yù)試驗的978個候選增強子用相同的gRNA對重新靶向，并且其中377個也用第二個替代gRNA進行靶向。（圖C）gRNA再次遞送至K562細胞，但感染復(fù)數(shù)高于預(yù)實驗（每個細胞中位數(shù)為28±15.3gRNA）。（圖D）共產(chǎn)生207,324個單細胞轉(zhuǎn)錄譜。每個擾動在915±280個單細胞中鑒定。

（圖E）差異表達測試的Q-Q圖。顯示了靶基因表達（橙色）的減少。

（圖F）每個候選增強子影響的靶基因數(shù)目的直方圖（10％經(jīng)驗FDR）。

（圖G）作為調(diào)節(jié)每個靶基因而檢測到的成對候選增強子數(shù)的直方圖（10％FDR）。

（圖H）篩選出664個（470個高可信度）增強子-基因?qū)Φ男?yīng)值（通過10%FDR）。97%的TSS對照，測序數(shù)據(jù)確定其基因表達被抑制。

l  單例實驗對22個選定的Enhancer-Gene對進行復(fù)制和驗證（包括16個增強子-基因?qū)?，?個沒有靶基因的增強子）。驗證結(jié)果表明，13個增強子的效力和方向與前期試驗一致，而3/16未能驗證。

l  解析人類增強子的性質(zhì)以及增強子和配對靶基因啟動子之間的距離:（圖A）成對的候選增強子在位置上靠近靶基因。（圖B）470個高可信度對中的317個靶向最近端的K562表達基因。（圖C）增強子對不同基因群的調(diào)控效應(yīng)。（圖E）增強子 - 基因?qū)υ?/span>K562 Hi-C數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出更頻繁地相互作用。

研究結(jié)論：該研究框架將促進增強子-基因調(diào)控相互作用的大規(guī)模圖譜繪制，增強子 - 基因調(diào)控相互作用是人類基因組順式調(diào)控環(huán)境中一個關(guān)鍵但尚未完全已知的組成部分。