Hepatology--單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序：僅1個組織樣本+2種細(xì)胞系

發(fā)稿時間：2019-02-25來源：天昊生物

 

文章題目

Single-Cell Analysis Reveals Cancer Stem Cell Heterogeneity in Hepatocellular Carcinoma, Hepatology, IF: 14.079, 2018年7月，DOI: 10.1002/hep.29778.

 

研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）的異質(zhì)性對于其治療是個巨大的阻礙，然而在單細(xì)胞水平上揭示HCC瘤內(nèi)異質(zhì)性的報道還十分有限。腫瘤干細(xì)胞（CSCs）在腫瘤異質(zhì)性中扮演重要角色，同時助長了治療抗性、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此急需從腫瘤細(xì)胞群落、細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)和特定癌種的細(xì)胞多樣性等角度去了解瘤內(nèi)異質(zhì)性。當(dāng)前的研究策略多是基于bulk tissue（塊狀組織），這樣的方法不足以很好地揭示腫瘤進(jìn)化和細(xì)胞群落。然而單細(xì)胞測序技術(shù)是解決這一問題的完美方案！

 

技術(shù)路線

 

 

主要內(nèi)容

 

1. 肝CSCs表型和異質(zhì)性驗(yàn)證

基于已經(jīng)明確的HCC CSCs細(xì)胞表面marker，首先利用免疫熒光染色和流式分析表征商業(yè)化的抗體鑒定不同CSC亞群的能力，包括CD13, CD24, CD44, CD90, CD133, 和EpCAM（圖1）。共聚焦成像顯示HuH1和HuH7細(xì)胞系無論在單分子層（圖1A）或球狀（圖1B）的狀態(tài)下，CSC亞群的異質(zhì)性均比較顯著。

 

圖1 HCC細(xì)胞CSC表面marker異質(zhì)性表達(dá)

然后利用流式基于單個marker分選CSC亞群，于96孔板培養(yǎng)評估其自我更新（self-renewal）的潛能。HuH1中大約15%-20% marker陽性的CSC（圖2A），HuH7中大約8%-12%可以分化（圖2B），而低氧條件下（促進(jìn)干性）只有特定的CSC亞群能夠分化（圖2A, B）。然后對培養(yǎng)2周后的單個marker表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)在HuH1和HuH7細(xì)胞中不同CSC亞群其自我更新能力差異巨大（圖2C, D）。而與未分選的細(xì)胞相比，單個marker表達(dá)的細(xì)胞可以在不同程度上擴(kuò)展形成混合的CSCs群（圖2E）。

 

圖2 marker明確的CSC功能分析

總體上這些結(jié)果能夠說明利用單個細(xì)胞表面marker能夠發(fā)現(xiàn)明顯的CSC亞群，它們具有高度的自我更新的能力。

 

2. 單個肝CSCs轉(zhuǎn)錄組圖譜及異質(zhì)性

為了確定單個marker表達(dá)的CSC中生物學(xué)差異是否與不同的分子特征相關(guān)，首先利用單細(xì)胞SMART-seq技術(shù)對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行表征，方法策略詳見技術(shù)路線，分別對單個細(xì)胞、10個或100個細(xì)胞的pool進(jìn)行分析，同時結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的公共數(shù)據(jù)比較，包括人胚胎干細(xì)胞（hSEC）、小鼠內(nèi)皮細(xì)胞（mEC）、小鼠造血干細(xì)胞（mHSC）。主成分分析發(fā)現(xiàn)，每種細(xì)胞類型有明顯不同的轉(zhuǎn)錄組特征（圖3A）。無論是HCC細(xì)胞系還是新鮮分離的腫瘤樣本，每個細(xì)胞群下的單個細(xì)胞其轉(zhuǎn)錄組是不同的，但是這樣的不同在10個或100個細(xì)胞的pool中會消失，這表明轉(zhuǎn)錄組的異質(zhì)性確實(shí)在單細(xì)胞水平上存在，而在pool樣本中顯著降低（圖3A）。單個HuH7細(xì)胞基于marker表達(dá)聚類結(jié)果如圖3B。

 

圖3A-B 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示marker明確的CSC異質(zhì)性

如果單細(xì)胞中marker基因表達(dá)帶來的轉(zhuǎn)錄組差異在功能上是重要的，那這些改變應(yīng)當(dāng)與HCC生存相關(guān)。因此基于3個marker陽性（Triple⁺）和陰性（Triple^-）（CD133/CD24/EpCAM）進(jìn)行分類比較，其中286個基因與Triple⁺相關(guān)。利用這286個基因特征進(jìn)行預(yù)后分析，LCI cohort腫瘤樣本中log-rank和permutation分析Triple⁺能夠預(yù)測整體生存率，交叉驗(yàn)證的結(jié)果更顯著（圖3C）；而在非腫瘤樣本中不存在這樣的關(guān)系（圖3D），這說明Triple⁺ marker特征是腫瘤特異性的。相似的結(jié)果在TCGA cohort中也有發(fā)現(xiàn)（圖3E）。

 

圖3C-E 基于特征基因進(jìn)行生存風(fēng)險預(yù)測

對HuH7細(xì)胞中基于單個marker分選的CSC亞群分析發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)重疊較少（圖4A），網(wǎng)絡(luò)分析顯示與不同maker基因特征相關(guān)的top networks大部分也不能重疊（圖4C-F）。而這些marker特征能夠預(yù)測不同cohort的整體生存率（圖4B）。

 

圖4 marker明確的CSC顯著不同的分子信號及預(yù)后相關(guān)

 

3. 肝細(xì)胞群轉(zhuǎn)錄組圖譜及異質(zhì)性

為了確定整體細(xì)胞群的多樣性，利用10x Genomics GemCode技術(shù)對HuH1, HuH7和P1中的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，共3847個單細(xì)胞以tSNE可視化（圖5），與明確的marker狀態(tài)下單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)一致，出現(xiàn)明顯不同的細(xì)胞類型（圖5A）。已知的CSC marker基因，已知的HCC特異的基因以及干性相關(guān)/免疫細(xì)胞基因的表達(dá)特征如圖5B-D，說明細(xì)胞間異質(zhì)性存在。

 

圖5 10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)展示

 

結(jié)論

文章最后也討論了研究的局限性：僅僅依據(jù)兩種HCC細(xì)胞系和一個臨床樣本；數(shù)據(jù)的優(yōu)化問題。而文章揭示的HCC中CSC分子組成和異質(zhì)性可能對于CSC靶向治療有重要作用，基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)評估CSC異質(zhì)性及預(yù)后的價值能對瘤內(nèi)異質(zhì)性、腫瘤進(jìn)展和臨床意義提供新的視角。

 

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