淺談：論微生物絕對(duì)定量VS相對(duì)定量的優(yōu)越性

發(fā)稿時(shí)間：2019-03-06來源：天昊生物

    

●當(dāng)前常規(guī)細(xì)菌16S擴(kuò)增子測(cè)序方法能解析樣本中的物種組成和其相對(duì)豐度信息，因此對(duì)微生態(tài)研究具有重要的促進(jìn)作用。然而我們需要注意一點(diǎn)，那就是相對(duì)豐度并不能反映樣本每種微生物的真實(shí)數(shù)量和組間樣本的真實(shí)差異，這是為什么呢？這是因?yàn)橛捎诔Ｒ?guī)細(xì)菌16S擴(kuò)增子測(cè)序每個(gè)樣本之間對(duì)應(yīng)的 reads 數(shù)量差距較大，為避免因樣本數(shù)據(jù)大小不同而造成分析時(shí)的偏差，需對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，一般選擇測(cè)序樣本中最少 reads 數(shù)作為基數(shù)， 即將所有樣本的 reads 數(shù)統(tǒng)一抽平到該值， 因此抽平處理使相對(duì)豐度分析忽略了不同樣本之間總體微生物量存在的現(xiàn)實(shí)差異，造成了分析結(jié)果的偏差，而絕對(duì)定量分析則是計(jì)算樣本每種微生物的拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，因此絕對(duì)定量分析能反映樣本每種微生物的真實(shí)數(shù)量和組間樣本的真實(shí)差異，因此絕對(duì)定量分析相對(duì)于相對(duì)定量分析更能反映樣本細(xì)菌群落的真實(shí)變化，是進(jìn)行微生態(tài)研究的首選，下面小編就拿幾篇研究文章的結(jié)果舉例證明。

 

文章一  微生物絕對(duì)定量分析真正將腸道菌群變化與微生物載量聯(lián)系起來

 

英文題目: Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load

中文題目：微生物絕對(duì)定量分析真正將腸道菌群變化與微生物載量聯(lián)系起來

期刊名：Nature

發(fā)表時(shí)間：2017年

支持證據(jù)：

• 為了證明絕對(duì)定量數(shù)據(jù)（QMP）在臨床研究中的潛在作用，我們對(duì)29例克羅恩病患者和健康人的樣本進(jìn)行絕對(duì)定量數(shù)據(jù)分析。流式細(xì)胞儀分析表明，克羅恩病患者糞便樣品中的細(xì)胞數(shù)比健康對(duì)照組低3倍（圖4a）。
• 發(fā)現(xiàn)只在應(yīng)用相對(duì)數(shù)據(jù)RMP分析時(shí)，類桿菌Bacteroides才與克羅恩病相關(guān)（圖4b左），僅在使用絕對(duì)定量數(shù)據(jù)QMP時(shí)，普雷沃菌屬Prevotella才在克羅恩病患者中發(fā)現(xiàn)顯著降低（圖4b右）。
• 以上這些觀察強(qiáng)調(diào)了相對(duì)數(shù)據(jù)（RMP）分析的局限性：來源于相對(duì)數(shù)據(jù)（RMP）分析的一個(gè)錯(cuò)誤結(jié)果解釋可能提示類桿菌Bacteroides在克羅恩病的發(fā)病或發(fā)展中的假因果關(guān)系，為什么會(huì)出現(xiàn)這種假因果關(guān)系，這是因?yàn)橄鄬?duì)定量分析忽視了健康對(duì)照和克羅恩病患者腸道微生物總豐度的巨大差異（差3倍），通過人為抽平處理認(rèn)為樣本間微生物總豐度一致，從而造成上述錯(cuò)誤，因此本文認(rèn)為只有絕對(duì)定量數(shù)據(jù)（QMP）分析鑒定到的微生物總豐度降低才是引起克羅恩病患者腸道微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的根本原因。作者認(rèn)為目前大多數(shù)對(duì)于腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究并不能體現(xiàn)出具體微生物數(shù)量改變對(duì)宿主帶來的影響，這些相對(duì)比例研究忽略了總體微生物豐度本身的改變可能是引起宿主產(chǎn)生疾病的主要原因這一可能性。所以，為了真正體現(xiàn)宿主-微生物群的相互作用，微生物群的研究必須將比例變成絕對(duì)量。

 

圖4. 克羅恩病的微生物數(shù)量變化

 

文章二  微生物類群豐度的絕對(duì)定量

 

英文題目: Absolute quantification of microbial taxon abundances

中文題目：微生物類群豐度的絕對(duì)定量

期刊名：The ISME Journal

發(fā)表時(shí)間：2017年

支持證據(jù)：

• 本研究對(duì)核試驗(yàn)反應(yīng)堆上運(yùn)行的冷卻水回路系統(tǒng)進(jìn)行兩次40天調(diào)查（survey1和survey2），包括冷卻水系統(tǒng)沒有運(yùn)行的時(shí)間段（control），冷卻水系統(tǒng)啟動(dòng)階段（start-up），冷卻水系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)運(yùn)行階段（operation）。
• 仔細(xì)檢查了兩個(gè)微生物分支betI-A分支和bacI-A分支的釋相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的時(shí)間軌跡時(shí)間軌跡（圖2）。結(jié)果檢測(cè)到兩個(gè)主要差異：1）：在群落成長(zhǎng)期間，比如survey 1的start-up和早期 operation階段，絕對(duì)豐度有一個(gè)明確的過渡，顯示出bacI-A分支的生長(zhǎng)和衰變；相反，在生長(zhǎng)和衰變過程中，bacI-A分支的相對(duì)豐度則始終保持相對(duì)恒定，沒有任何過渡。2）：在survey2的operation后半部分，相對(duì)豐度曲線顯示從±40%增加到90%以上，暗示了betI-A分支的生長(zhǎng)；相反，如果看絕對(duì)豐度，那么這個(gè)分支就沒有明顯的活躍生長(zhǎng)，其細(xì)胞密度從未顯著超過start-up階段結(jié)束時(shí)觀察到的最大密度。◆
• 本文認(rèn)為微生物某一類群的富集（相對(duì)豐度比例的增加）不一定真正與相應(yīng)微生物類群生長(zhǎng)（絕對(duì)豐度的增加）有關(guān)，可能是其它微生物類群的衰退導(dǎo)致了其在群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度比例的增長(zhǎng)。◆

 

圖2 對(duì)在核試驗(yàn)反應(yīng)堆上運(yùn)行的二級(jí)冷卻水回路進(jìn)行兩次時(shí)間分離的40天調(diào)查期間，2個(gè)最豐富的微生物淡水分支(bacI-A(OTU2，紅色；OTU3，橙色)和betI-A(OTU1，藍(lán)色))的時(shí)間動(dòng)態(tài)圖。top panel顯示從擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)中推斷的相對(duì)豐度（in%），bottom panel顯示絕對(duì)OTU豐度（單位為細(xì)胞/μl）, 圓形標(biāo)簽表示微生物群落的總細(xì)胞密度（單位為細(xì)胞/μl±s.d）。最下方灰色區(qū)域表示冷卻水系統(tǒng)沒有運(yùn)行的時(shí)間段（控制階段），綠色區(qū)域表示啟動(dòng)，藍(lán)色區(qū)域表示穩(wěn)態(tài)運(yùn)行。

 

文章三  土壤絕對(duì)定量方法結(jié)合相對(duì)豐度能夠反映微生物類群的真實(shí)變化

 

英文題目: Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa

中文題目：土壤絕對(duì)定量方法結(jié)合相對(duì)豐度能夠反映微生物類群的真實(shí)變化

期刊名：Scientific Reports

發(fā)表時(shí)間：2017年

支持證據(jù)：

•  本文采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析了北京和西藏草原土壤微生物群落中主要物種的相對(duì)豐度，并采用三磷酸腺苷（ATP）、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、定量實(shí)時(shí)PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFA）和微生物量碳（MBC）等多個(gè)技術(shù)直接或間接地定量細(xì)菌的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)。然后將兩者相結(jié)合計(jì)算估計(jì)絕對(duì)豐度(EAA) （EAA定義為某微生物類群的相對(duì)豐度乘以總的絕對(duì)微生物細(xì)胞數(shù)）。
• 通過對(duì)土壤微生物群落中主要組分的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度(EAA)的比較，發(fā)現(xiàn)一些優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度(EAA) 表現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢(shì)：例如北京地區(qū)樣本中Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi 和 Gemmatimonates的相對(duì)豐度與西藏樣品無顯著差異，但北京地區(qū)樣本這些物種的估計(jì)絕對(duì)豐度EAA則顯著高于西藏樣品（圖2）。此外，北京地區(qū)Verrucomicrobia和Planctomycetes的相對(duì)豐度顯著高于西藏，但是其估計(jì)絕對(duì)豐度EAA則無明顯差異（圖2）。

 

圖2 北京和西藏草原主要門類相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度(EAA)差異的響應(yīng)比。在95%的置信水平下，使用響應(yīng)比分析確定顯著性。響應(yīng)變量的95%CI不與0重疊表示顯著結(jié)果，否則不顯著。響應(yīng)比大于零表示北京樣品的豐度大于西藏樣品，反之亦然。

• 根據(jù)結(jié)果，本文提出了將相對(duì)豐度與定量結(jié)果相結(jié)合得到一個(gè)估算絕對(duì)豐度EAA的概念模型（圖6）。如圖6所示，給定的群落1和群落2中均有5個(gè)物種（每個(gè)物種一種顏色)，群落1有N個(gè)個(gè)體，群落2有M個(gè)個(gè)體，其中N大約是M的一半，計(jì)算每種物種的相對(duì)豐度，同時(shí)將定量檢測(cè)與相對(duì)豐度相結(jié)合可得到估算絕對(duì)豐度EAA。當(dāng)僅基于相對(duì)豐度時(shí)，群落1中紅色物種的相對(duì)豐度高于群落2，但基于估算絕對(duì)豐度EAA時(shí)，群落1中紅色物種的估算絕對(duì)豐度EAA則低于群落2。因此本文認(rèn)為，與宏觀生態(tài)學(xué)一樣，相對(duì)豐度的差異也不適合解釋自然條件下微生物群落的真實(shí)豐度差異。

 

圖6 估計(jì)絕對(duì)豐度(EAA)與相對(duì)豐度和定量檢測(cè)之間關(guān)系的概念模型

 

各位看官讀完上述文章如果有想做微生物絕對(duì)定量的想法，那就請(qǐng)聯(lián)系天昊生物吧，天昊生物是國(guó)內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序”技術(shù)的服務(wù)商，。該方法通過向樣品DNA中添加一定量外標(biāo)序列，進(jìn)行16S擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序，再根據(jù)外標(biāo)序列的16S擴(kuò)增子reads數(shù)及其絕對(duì)拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中OTU代表序列對(duì)應(yīng)物種16S rRNA基因絕對(duì)拷貝數(shù)。該方法是一種將qPCR絕對(duì)定量技術(shù)和常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)合二為一的技術(shù)，該技術(shù)不但可以進(jìn)行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析和環(huán)境因子分析等常規(guī)擴(kuò)增子測(cè)序分析，而且可以解析樣本中總細(xì)菌和特定菌種的絕對(duì)拷貝數(shù)， 最大限度地便利了廣大微生態(tài)研究者。熱烈歡迎各位老師與我們交流溝通微生物絕對(duì)定量相關(guān)方面的問題~