DNA N6-methyladenine（6mA）中的明星分子和檢測(cè)方法

發(fā)稿時(shí)間：2019-03-28來(lái)源：天昊生物

在我們年初的一篇分享中《潛在熱點(diǎn)？——DNA 6mA甲基化修飾》，我們總結(jié)了human樣本中涉及DNA N6甲基腺嘌呤修飾（6mA）的6篇文章。本期我們針對(duì)文章中有關(guān)6mA修飾常用的檢測(cè)方法和調(diào)控的基因/酶做了簡(jiǎn)單的梳理，另外近期該領(lǐng)域又發(fā)表了一些新的paper。

 

方法

從2019年3月最新的一篇Nature綜述中總結(jié)的利用現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)解碼細(xì)菌表觀基因組能夠看出，單堿基分辨率條件下用于6mA檢測(cè)的方法有限制酶消化后測(cè)序、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序、納米孔測(cè)序。其中三代測(cè)序SMRT和Nanopore能夠直接檢測(cè)DNA甲基化修飾，無(wú)需PCR擴(kuò)增的步驟[1]。之前解讀的human樣本一篇文獻(xiàn)就有利用到SMRT的方法（下圖1）[2]。

 

圖1 SMRT用于6mA檢測(cè)

從2015年的Nature（圖2）和Cell（圖3）綜述中可以看出更加常用的方法包括基于免疫沉淀（IP）和質(zhì)譜（LC-MS/MS）的檢測(cè)[3, 4]，尤其是基于IP的方法。

 

圖2 Nature綜述中6mA檢測(cè)方法總結(jié)

 

圖3 Cell綜述中6mA檢測(cè)方法總結(jié)

基于6mA-IP-seq方法檢測(cè)6mA相關(guān)的research文章包括human樣本中涉及惡性膠質(zhì)瘤6mA修飾[5]、人類基因組6mA修飾圖譜等[6]（圖4）。測(cè)序后可以利用6mA-IP-qPCR對(duì)目的基因進(jìn)行驗(yàn)證分析。

 

 

 

圖4 6mA-IP-seq策略研究6mA修飾

通常這些文章中經(jīng)常還會(huì)設(shè)計(jì)dot blot（圖5A）和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)（圖5B）檢測(cè)6mA修飾總體水平以及6mA/A比例。基于6mA-IP也可以用于6mA總體水平定量。這些研究策略類似于m6A RNA甲基化常用的方法！

 

圖5 Dot blot和MS用于6mA總體水平定量

另外還有些文章開(kāi)發(fā)新的方法或者對(duì)IP策略進(jìn)行改進(jìn)利用在6mA檢測(cè)中，包括免疫熒光用于6mA可視化檢測(cè)等[5, 7, 8]。

修飾酶

從最新的2019年3月份Nature有關(guān)DNA修飾的綜述中總結(jié)中可以發(fā)現(xiàn)不同物種中6mA修飾和去修飾相關(guān)的酶（圖6）[9]。

 

圖6 DNA修飾及相關(guān)修飾酶

其中在human樣本中關(guān)注度比較高的為6mA去甲基化酶ALKBH1，如先前解讀的human樣本Cell [5]、Molecular Cell [6]、Bone Research [10]文章，Molecular Cell也研究了N6AMT1這一甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用。而NAR上突破性文章曾報(bào)道SSBP1作為6mA結(jié)合蛋白在線粒體DNA修飾和復(fù)制中的作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)ALKBH1作為一種線粒體蛋白與6mA去甲基化酶相關(guān)[11]。目前來(lái)看在人類樣本中經(jīng)驗(yàn)證的修飾酶的種類比較有限，期待后續(xù)更多的新發(fā)現(xiàn)。

 

數(shù)據(jù)庫(kù)

最后介紹一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)MethSMRT，SMRT測(cè)序整合的6mA和4mC數(shù)據(jù)，由中山大學(xué)開(kāi)發(fā)，但是目前收錄的物種沒(méi)有人，網(wǎng)址鏈接http://sysbio.sysu.edu.cn/methsmrt/[12]。

 

圖7 MethSMRT數(shù)據(jù)庫(kù)收錄物種

1. Beaulaurier, J., E.E. Schadt, and G. Fang, Deciphering bacterial epigenomes using modern sequencing technologies. Nat Rev Genet, 2019. 20(3): p. 157-172.

2. Zhu, S., et al., Mapping and characterizing N6-methyladenine in eukaryotic genomes using single-molecule real-time sequencing. Genome Res, 2018. 28(7): p. 1067-1078.

3. Luo, G.Z., et al., DNA N(6)-methyladenine: a new epigenetic mark in eukaryotes? Nat Rev Mol Cell Biol, 2015. 16(12): p. 705-10.

4. Heyn, H. and M. Esteller, An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell, 2015. 161(4): p. 710-3.

5. Xie, Q., et al., N(6)-methyladenine DNA Modification in Glioblastoma. Cell, 2018. 175(5): p. 1228-1243 e20.

6. Xiao, C.L., et al., N(6)-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome. Mol Cell, 2018. 71(2): p. 306-318 e7.

7. Liu, B., et al., Metabolically Generated Stable Isotope-Labeled Deoxynucleoside Code for Tracing DNA N(6)-Methyladenine in Human Cells. Anal Chem, 2017. 89(11): p. 6202-6209.

8. Liu, X., et al., Predominance of N(6)-Methyladenine-Specific DNA Fragments Enriched by Multiple Immunoprecipitation. Anal Chem, 2018. 90(9): p. 5546-5551.

9. Deniz, O., J.M. Frost, and M.R. Branco, Regulation of transposable elements by DNA modifications. Nat Rev Genet, 2019.

10. Zhou, C., et al., DNA N(6)-methyladenine demethylase ALKBH1 enhances osteogenic differentiation of human MSCs. Bone Res, 2016. 4: p. 16033.

11. Koh, C.W.Q., et al., Single-nucleotide-resolution sequencing of human N6-methyldeoxyadenosine reveals strand-asymmetric clusters associated with SSBP1 on the mitochondrial genome. Nucleic Acids Res, 2018. 46(22): p. 11659-11670.

12. Ye, P., et al., MethSMRT: an integrative database for DNA N6-methyladenine and N4-methylcytosine generated by single-molecular real-time sequencing. Nucleic Acids Res, 2017. 45(D1): p. D85-D89.