微生物絕對(duì)定量or相對(duì)定量,你選對(duì)了嗎

發(fā)稿時(shí)間：2019-04-15來源：天昊生物

 

前常規(guī)16S擴(kuò)增子測序在分析樣本間微生物組成時(shí)僅考慮微生物的相對(duì)豐度（比例），然而相對(duì)豐度信息不能反映樣本中微生物物種真實(shí)的絕對(duì)豐度情況，從而對(duì)樣品間菌群的真實(shí)變化分析造成嚴(yán)重誤判，而且多篇研究文獻(xiàn)已經(jīng)證明只有絕對(duì)定量分析才能反映樣本每種微生物的真實(shí)數(shù)量和組間樣本的真實(shí)差異，因此絕對(duì)定量才是微生態(tài)研究的首選。我司于去年下半年推出微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測序技術(shù)以來，受到醫(yī)學(xué)腸道和環(huán)境微生物領(lǐng)域老師同學(xué)們的廣泛歡迎和好評(píng)。今天小編就通過一系列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)系統(tǒng)展示一下絕對(duì)定量VS相對(duì)定量的優(yōu)勢！

 

Demo 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì)

將9種標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA按一定比例混合，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品DNA。group1：向10ng標(biāo)準(zhǔn)品DNA（微生物DNA占比100%）中添加10ⁿ拷貝外標(biāo)序列，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；group2：將標(biāo)準(zhǔn)品DNA與hela細(xì)胞基因組DNA按照質(zhì)量比1:9的比例混合，混合后微生物DNA占比10%，然后向上述10ng DNA（微生物DNA占比100%）中添加和group1相同拷貝數(shù)的外標(biāo)序列，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。然后用天昊微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測序技術(shù)對(duì)上述2組樣品進(jìn)行檢測，將絕對(duì)定量分析（AQ）和相對(duì)定量分析（RQ）結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

注：上述2組間樣本只是在微生物總量相差10倍，組間樣本同一個(gè)菌/總菌的比例完全相同。

 結(jié) 果 展 示

Alpha多樣性分析

 

多樣性指數(shù)分析

結(jié)論：demo樣本因?yàn)槭琴徺I的標(biāo)準(zhǔn)菌株混合后的樣本，物種組成較單一（共9種），所有樣本基于相對(duì)定量分析（RQ）和絕對(duì)定量分析（AQ）得到的群落Observed species均完全一致（都是9種）， shannon和simpson指數(shù)也相似。

注意：現(xiàn)實(shí)樣本通過相對(duì)定量分析（RQ）得到的Observed species個(gè)數(shù)以及shannon和simpson指數(shù)都會(huì)比絕對(duì)定量分析（AQ）低，原因是抽平使得OTU個(gè)數(shù)減少，低豐度OTU的數(shù)據(jù)丟失。 

  

Beta多樣性分析

 

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基于Euclidean（考慮物種有無、絕對(duì)豐度）的PCA分析：絕對(duì)定量分析（AQ）中Group1和Group2兩組整體菌群組成差異較大，第一象限的差異解釋率達(dá)98%，而相對(duì)定量分析（RQ）中Group1和Group2兩組組成更為相似。

原因分析：這是因?yàn)榛?/span>Euclidean距離的PCA分析考慮物種組成和物種絕對(duì)豐度情況，group1和group2物種組成相同，所以AQ和RQ分析結(jié)果的差異主要取決于兩種分析得到的物種絕對(duì)豐度的差異。

 

PCoA分析

基于Bray-Curtis（考慮物種有無、絕對(duì)豐度）的PCoA分析：絕對(duì)定量分析（AQ）中Group1和Group2兩組整體菌群組成差異較大，第一象限的差異解釋率達(dá)99%，而相對(duì)定量分析（RQ）中Group1和Group2兩組組成更為相似。

原因分析：這是因?yàn)榛?/span>Bray-Curtis距離的PCoA分析考慮物種組成和物種絕對(duì)豐度情況，group1和group2物種組成相同，所以AQ和RQ分析結(jié)果的差異主要取決于兩種分析得到的物種絕對(duì)豐度的差異。

 

基于Weighted UniFrac（考慮物種有無、遺傳距離、相對(duì)豐度）的PCoA分析：絕對(duì)定量分析（AQ）和相對(duì)定量分析（RQ）的結(jié)果相似。

原因分析：這是因?yàn)榛?/span>Weighted UniFrac距離的PCoA分析考慮物種組成和物種相對(duì)豐度占比情況，group1和group2物種組成相同，而兩種分析得到的物種在樣本中的相對(duì)豐度比較一致，所以AQ和RQ分析結(jié)果相似。

 

 

群落組成分析

Barplot分析

結(jié)論：絕對(duì)定量分析（AQ）和相對(duì)定量分析（RQ）得到的群落組成結(jié)果差異巨大，而絕對(duì)定量分析（AQ）結(jié)果完全符合理論預(yù)期。

原因分析：AQ是以物種真實(shí)的絕對(duì)拷貝數(shù)為基礎(chǔ)，RQ是以抽平的序列數(shù)為基礎(chǔ)，因?yàn)槌槠饺藶閷⒉煌瑯颖鹃g的微生物總量調(diào)成一致，掩蓋了樣本間微生物總量的真實(shí)差異。 

 

Heatmap分析 

 

結(jié)論：絕對(duì)定量分析（AQ）和相對(duì)定量分析（RQ）得到的熱圖（橫坐標(biāo)為9種菌，縱坐標(biāo)為不同組間樣本），結(jié)果差異巨大，而絕對(duì)定量分析（AQ）結(jié)果完全符合理論預(yù)期。

原因分析：AQ是以物種真實(shí)的絕對(duì)拷貝數(shù)為基礎(chǔ)，RQ是以抽平的序列數(shù)為基礎(chǔ)，因?yàn)槌槠饺藶閷⒉煌瑯颖鹃g的微生物總量調(diào)成一致，掩蓋了樣本間微生物總量的真實(shí)差異。 

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)

 

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果說明如果樣本間微生物總量本身存在差異，使用傳統(tǒng)的相對(duì)定量分析會(huì)造成錯(cuò)誤的研究結(jié)論，所以，為了得到樣本間細(xì)菌群落的真實(shí)變化結(jié)果，微生態(tài)的研究必須用絕對(duì)定量分析替代傳統(tǒng)的相對(duì)定量分析。

以上就是天昊16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測序部分更新內(nèi)容和亮點(diǎn)，當(dāng)然我們也會(huì)繼續(xù)升級(jí)有應(yīng)用價(jià)值的分析內(nèi)容，感興趣的小伙伴們可以關(guān)注天昊生物微信公眾號(hào)，小編會(huì)不定期更新哦。

 

客 戶 合 作 情 況

作為國內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測序”技術(shù)的服務(wù)商，我們首先感謝客戶的信任和選擇，僅僅在2018年第四季度，微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測序技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)完成項(xiàng)目數(shù)十個(gè)，合作的單位包括中國科學(xué)院南京土壤研究所、中國科學(xué)院水生生物研究所、廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城工學(xué)院、南京財(cái)經(jīng)大學(xué)、南京中醫(yī)藥大學(xué)、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院等多個(gè)單位，覆蓋環(huán)境微生物和腸道微生物等領(lǐng)域。

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