魚和熊掌不可兼得？不，兩者我都要！

發(fā)稿時間：2019-04-28來源：天昊生物

魚，我所欲也，熊掌亦我所欲也；

魚，我所欲也，熊掌亦我所欲也；

       二者不可得兼，舍魚而取熊掌者也。

——孟子《魚我所欲也》

魚和熊掌，二者取其一，是古代賢能告知我們不要貪心，要學(xué)會取舍，在我們微生態(tài)群落研究中也會遇到同樣的問題，相對定量（序列相對比例）分析和絕對定量（16S 拷貝數(shù)）分析，不知道選哪個？要不兩個都要？兩個放在一起對比一下看看？有這些想法的老師同學(xué)們不要擔(dān)心，因為我們天昊生物可以幫您成全“魚與熊掌”兼得的美事。

我司于去年下半年推出微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)以來，微生物16S擴增子絕對定量測序項目報告不但同時提供相對定量和絕對定量兩套分析結(jié)果，同時兼顧客戶研究方便的考量，精益求精，貼心地將基于相對定量數(shù)據(jù)（Relative Quantitation，下文簡稱RQ）分析結(jié)果和基于絕對定量數(shù)據(jù)（Absolute Quantitation，下文簡稱AQ）分析結(jié)果進行聯(lián)合對比分析，找出不同定量分析方法得到的結(jié)果異同，下面我們就節(jié)選一部分兩種分析方法的聯(lián)合分析結(jié)果（群落組成對比分析）做相應(yīng)展示。

 

群落組成對比分析原因

 

上圖是微生物絕對定量分析（AQ）和相對定量分析（RQ）最大差異的體現(xiàn)之處，但是哪些差異物種是兩種定量分析方法共同篩選到的？哪些差異物種是某種定量分析方法特異篩選到的？另外兩種定量方法中篩選到的差異物種組間變化趨勢是否相同？帶著這些疑問，我們對絕對定量分析結(jié)果（AQ）和相對定量分析結(jié)果（RQ）進行聯(lián)合對比分析。

 

 

群落組成對比分析結(jié)果展示

Wilcoxon結(jié)果比對分析

Wilcoxon秩和檢驗，是一種常用于分析兩兩分組間的樣本總體分布是否存在差異的非參數(shù)檢驗方法。利用Wilcoxon秩和檢驗對兩兩分組間樣本進行比較，在各分類水平上找出兩組中具有顯著差異的物種，以P < 0.05作為差異顯著性篩選閾值，對于組間豐度顯著差異的物種繪制箱體圖。

本分析對比各分類水平上RQ（相對定量分析）和AQ（絕對定量分析）的Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果，找出以下3類物種：

1) 在RQ和AQ分析中，組間差異均顯著的物種，

2) 僅在RQ分析中，組間差異顯著的物種，

3) 僅在AQ分析中，組間差異顯著的物種。

下圖是綱水平（class）兩種定量方法的差異物種分布比較Venn圖展示結(jié)果。

 

圖1  兩種定量方法的差異物種分布比較Venn圖

注：不同的顏色表示不同定量方法，不同顏色圓圈重疊的區(qū)域標(biāo)注數(shù)字表示共有的物種數(shù)。

 

圖2 兩種定量方法中差異物種的對比箱體圖

注：不同顏色分別代表樣本不同組別，橫坐標(biāo)表示該分類水平的差異物種，縱坐標(biāo)為相對豐度（左：基于RQ）和絕對豐度值（右：基于AQ）；顯著性標(biāo)記：**** P<0.0001，*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05。

                     

Kruskal_Wallis結(jié)果比對分析

Kruskal-Wallis檢驗是一種常用于分析多組樣本間的總體分布是否存在差異的非參數(shù)檢驗方法。利用Kruskal-Wallis檢驗對3組以上的組間樣本進行比較，在各分類水平上找出組間差異顯著的物種。以P < 0.05作為差異顯著性篩選閾值，對于組間豐度顯著差異的物種繪制箱體圖。

本分析對比各分類水平上RQ（相對定量分析）和AQ（絕對定量分析）的Kruskal-Wallis方差分析結(jié)果，找出以下3類物種：

1）在RQ和AQ分析中，組間差異均顯著的物種，

2）僅在RQ分析中，組間差異顯著的物種，

3）僅在AQ分析中，組間差異顯著的物種。

下圖是綱水平（class）兩種定量方法的差異物種分布比較Venn圖展示結(jié)果。

 

圖3 兩種定量方法的差異物種分布比較Venn圖

注：不同的顏色表示不同定量方法，不同顏色圓圈重疊的區(qū)域標(biāo)注數(shù)字表示共有的物種數(shù)。

 

 

圖4兩種定量方法中差異物種的對比箱體圖

注：不同顏色分別代表樣本不同組別，頂部標(biāo)題表示該分類水平的差異物種，縱坐標(biāo)為相對豐度（左：基于RQ）和絕對豐度值（右：基于AQ）。

 

ANOVA結(jié)果比對分析

ANOVA方差分析用于兩個及兩個以上分組均數(shù)差別的顯著性檢驗，在各分類水平上找出多組中具有顯著差異的物種。以p value < 0.05作為差異顯著性篩選閾值，對于組間豐度顯著差異的物種繪制箱體圖。

本分析對比各分類水平上RQ和AQ的ANOVA方差分析結(jié)果，找出以下3類物種：

1）在RQ和AQ分析中，組間差異均顯著的物種，

2）僅在RQ分析中，組間差異顯著的物種，

3）僅在AQ分析中，組間差異顯著的物種。

下圖是綱水平（class）兩種定量方法的差異物種分布比較Venn圖展示結(jié)果。

 

圖5 兩種定量方法的差異物種分布比較Venn圖

注：不同的顏色表示不同定量方法，不同顏色圓圈重疊的區(qū)域標(biāo)注數(shù)字表示共有的物種數(shù)。

 

 

圖6 兩種定量方法中差異物種的對比箱體圖

注：不同顏色分別代表樣本不同組別，頂部標(biāo)題表示該分類水平的差異物種，縱坐標(biāo)為相對豐度（左：基于RQ）和絕對豐度值（右：基于AQ）。

 

 

圖7 兩種定量方法中差異物種組間變化趨勢的對比折線圖

注：不同的顏色表示不同定量方法，頂部標(biāo)題表示該分類水平的差異物種，縱坐標(biāo)為相對豐度（左：基于RQ）和絕對豐度值（右：基于AQ），errorbar為標(biāo)準(zhǔn)誤SE。

 

 

實驗數(shù)據(jù)總結(jié)

 

上述實驗數(shù)據(jù)結(jié)果說明是微生物相對定量分析（RQ）和絕對定量分析（AQ）在群落組成分析方面可能存在差異，具體表現(xiàn)在：（1）兩種定量分析方法可以篩選到共同的差異物種；（2）兩種定量分析方法可以篩選到各自特異的差異物種；（3）兩種定量分析方法中篩選到的差異物種組間變化趨勢可能有所不同。

以上就是天昊16S擴增子絕對定量測序部分更新內(nèi)容和亮點，當(dāng)然我們也會繼續(xù)升級有應(yīng)用價值的分析內(nèi)容，感興趣的小伙伴們可以關(guān)注天昊生物微信公眾號，小編會不定期更新哦。

 

客戶合作情況

作為國內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴增子絕對定量測序”技術(shù)的服務(wù)商，我們首先感謝客戶的信任和選擇，僅僅在2018年第四季度，微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)平臺已經(jīng)完成項目數(shù)十個，合作的單位包括中國科學(xué)院南京土壤研究所、中國科學(xué)院水生生物研究所、廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城工學(xué)院、南京財經(jīng)大學(xué)、南京中醫(yī)藥大學(xué)、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、溫州醫(yī)科大學(xué)、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院等多個單位，覆蓋環(huán)境微生物和腸道微生物等領(lǐng)域。

    2019年，我們期待，與您的合作！