10x Genomics單細胞轉錄組測序在動物腦組織研究中的應用

發(fā)稿時間：2019-05-23來源：天昊生物

自從2017年1月發(fā)表的Nature Communications文章，首次基于10x Genomics平臺對29個樣本的約25萬個細胞進行大規(guī)模單細胞RNA測序（scRNA-seq）以來，利用該平臺針對人類和動物不同組織和發(fā)育過程，發(fā)表的單細胞轉錄組測序高分文章便出現爆發(fā)式增長，今天就跟大家梳理一下10x Genomics單細胞RNA測序在小鼠、果蠅、斑馬魚等動物腦組織研究中的應用。

 

1、A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain

題目：果蠅大腦老化單細胞轉錄組圖譜

發(fā)表雜志：Cell 影響因子：31.398  發(fā)表日期：2018-8-9

 

 

研究內容：

通過對成年果蠅大腦單細胞圖譜檢測，確定了神經元和神經膠質細胞類型及其在衰老過程中的動態(tài)變化情況。

實驗材料：

所有果蠅在25oC、12h/12h光照周期的酵母培養(yǎng)基上飼養(yǎng)。在老化實驗中，每個小瓶中放入20只雌性和10只雄性果蠅，每4天將果蠅轉移到新的小瓶中。成年果蠅在0、1、3、6、9、15、30和50天大時被使用。

實驗方法：

大腦單細胞分離

將40只果蠅大腦(20只雌性和20只雄性)解剖并轉移到含有冰冷DPBS溶液的試管中。離心5分鐘后，上清液被dispase和collagenase替換。大腦在25oC中以1000轉/分鐘速度解離2h。用冰冷的DPBS溶液洗滌細胞，并在DPBS BSA中再懸浮30-40個大腦。細胞懸液通過pluriStrainer (ImTec Diagnostics_435001050)儀器。細胞活力和濃度由LUNA-FL雙熒光細胞計數器評估。

分離后的單細胞進行后續(xù)10x Genomics單細胞分選。此外，本研究還用到了免疫熒光、ATAC-seq、細胞核分離、Bulk RNA-seq、SMART-Seq2和CEL-Seq2等方法。

 

實驗結果：

1）成年果蠅大腦scRNA-seq及細胞類型鑒定

本研究使用10x Genomics平臺，對8個不同時間點的果蠅成年大腦單細胞進行分選測序。最終獲得56902 (57K)個高質量細胞數據(DGRP-551約29K個細胞，w1118約28K個細胞)。在所有細胞中檢測到的基因總數為12436個蛋白質編碼基因和2164個非編碼核糖核酸。每個細胞的基因中位值在1308 (0天)到810 (50天)之間。根據分辨率的不同，對細胞進行聚類后得出87–151個細胞聚類（圖1）。

研究者通過名為SCope的在線資源提供所有集群信息和每個集群的標記。使用兩種方法將細胞群與已知的細胞類型聯系起來，包括a）將每個細胞群的識別標記與先前公布的已知細胞類型的標記基因進行比較的方法，以及b）將單細胞群中的基因表達與之前發(fā)表的果蠅大腦亞群轉錄組進行比較，通過回歸模型擬合獲得高度相似性細胞簇。

 

 

圖1、單細胞RNA測序鑒定的成熟果蠅大腦細胞類型分析（57000個腦細胞t-SNE圖）

2）利用靶向細胞分選和亞聚類鑒定稀有細胞類型

為了鑒定未標記的細胞簇并將它們映射到特定的神經元群體上，利用已知的Gal4系可用于在特定的細胞群體中表達綠色熒光蛋白，進行FAC(熒光激活細胞)分選和分析，通過CEL-Seq2和SMART-Seq2方法檢測出更多基因，并成功對細胞類型進行了鑒定。

3）利用SCENIC繪制細胞類型特異性調控網絡

研究者對鑒定的細胞類型所具有的特定基因調控網絡和轉錄因子活性特征進行了分析，為此開發(fā)了SCENIC數據庫，并發(fā)現了150個轉錄因子識別基序在共表達的基因集中顯著富集。與Seurat相比，使用這些基因網絡(而不是單獨的基因表達)的細胞聚類產生了不同的t-SNE投影。結果表明，大量神經元具有共同的調節(jié)狀態(tài)。

4）中樞大腦的調節(jié)狀態(tài)可以預測氧化磷酸化水平

研究者通過探索調節(jié)子活性矩陣的PCA進一步研究了SCENIC t-SNE。結果表明，基于推斷的基因調控網絡的細胞聚類可以對神經元進行分組。為了探討這種細分是否反映了功能差異，本研究評估了三個神經元組之間的差異基因表達譜，然后進行GO富集分析，并通過對線粒體翻譯相關基因分析最終表明，衰老影響基因豐度。然而細胞類型保持不變。參與氧化磷酸化和線粒體周轉的基因下降最快。

5）SCope：基于云的單細胞細胞圖譜工具

研究者最后開發(fā)了一個用戶友好的在線應用工具SCope (http://scope.aertslab.org)。提供了果蠅、小鼠及人類等腦細胞單細胞數據集。

 

2、Comprehensive Identification and Spatial Mapping of Habenular Neuronal Types Using Single-Cell RNA-Seq

題目：單細胞RNA測序對韁核神經元類型的綜合識別和空間定位

發(fā)表雜志：Current Biology 影響因子：8.851  發(fā)表日期：2018-4-2

 

 

 

 

研究內容：

本研究使用scRNA-seq來鑒定了幼年和成年斑馬魚韁核中不同的神經元類型。

實驗材料：

幼年和成年斑馬魚生長在25oC、12h/12h光照周期環(huán)境中。在實驗中使用受精后10天的幼年仔魚和1歲左右的成年雄性和雌性斑馬魚。

實驗方法：

10x Genomics相關細胞分離和文庫制備

解剖來自25條gng8-GFP魚的頭部，分離細胞如前所述。將大約6000-8000個細胞立即分選到20微升PBS中。分選是用貝克曼MoFlo Astrios超高速流式分選系統進行的，分選壓力在20psi。這是一個關鍵的步驟，因為更高的分選壓力導致分選后過量的細胞死亡。所得單細胞懸液被迅速裝載到10x Genomics系統中。分選后的細胞在冰上保存不超過10分鐘，因為通過臺盼藍染色測量的細胞生存力隨時間下降。

對于成年魚的實驗，基于gng8-GFP標記的表達，將6個成年韁核直接從大腦中解剖出來。木瓜蛋白酶酶解后，將所得細胞在PBS+BSA中洗滌一次，并通過20微米細胞過濾器過濾。然后重懸細胞后在血細胞計數器上計數。通過臺盼藍染色評估細胞活力，并在確保懸浮細胞活力大于80%后，將細胞以約300細胞/微升的濃度裝載到10x Genomics系統中。10x Genomics文庫構建根據廠商說明進行。

SMART-seq2相關細胞分離及文庫制備

幼魚頭部解剖切割后，使用Papain Dissociation Kit迅速解離，酶解后將細胞重新懸浮在EBSS溶液中。得到的細胞懸液通過20微米細胞過濾器并置于冰上。加入兩種活力指示劑(calcein blue活細胞染色劑和ethidium homodimer死細胞染色劑)。如果通過calcein blue染色測量的細胞存活率大于85%，則立即將細胞直接分選到含有裂解緩沖液的96孔板中。所有樣品立即冷凍在干冰中，并儲存在-80℃直至進一步處理。

為了制備SMART-seq2文庫，將含有單細胞裂解物的平板在冰上解凍，用beads純化。然后將beads風干并迅速加工用于合成cDNA。SMART-seq2文庫使用常規(guī)方法進行。

實驗結果：

1）斑馬魚幼體單神經元的分離和轉錄譜分析

由于scRNA-seq以前沒有應用于斑馬魚神經元，本實驗設計并優(yōu)化了一個從斑馬魚大腦中分離和捕獲單個神經元的方案。實驗發(fā)現，成功的實驗需要溫和的研磨，減少解離后的處理時間，以及熒光激活細胞分選(FACS)過程中最小的分選壓力。實驗使用gng8-GFP轉基因系對韁核細胞進行分類，該轉基因系選擇性地標記韁核中的大多數神經元（圖1）。

 

圖1、scRNA-Seq數據的無偏聚類確定了幼體韁核中15個分子不同的神經元簇

使用兩個互補的scRNA-Seq平臺(圖1B：(1)基于大規(guī)模平行液滴的3’端scRNA-Seq (商業(yè)10x Chromium平臺)和(2)低通量基于平板的全長scRNA-Seq (SMART-Seq2)。使用基于液滴的scRNA-seq從4365個幼體細胞中獲得數據，使用SMART-seq2(以下簡稱SS2數據集)從1152個幼體細胞中獲得數據。盡管斑馬魚神經元中的核糖核酸水平很低，本實驗平均檢測到1350個(液滴法)和3850 (SS2法)個基因/細胞。因此，多個scRNA- seq平臺可以有效地應用于斑馬魚大腦中的神經元。

2）鑒定了15個轉錄上不同的聚類簇

在幼體韁核中，為了識別神經元類型使用了液滴數據集法。在4233個過濾細胞中獲得13160個基因的基因表達矩陣。對1436個可變基因的基因表達矩陣進行了PCA分析，鑒定出36個具有統計學意義的主成分。這些計算機被用來建立細胞的k最近鄰圖，然后使用算法將其劃分為14個轉錄不同的聚類，并用t-分布隨機鄰域嵌入(t-SNE)將所得的16個聚類二維可視化(圖1C)，并評估差異基因表達以鑒定聚類特異性標記(圖1D)。

3）大多數先前描述的特異性基因在多個神經元簇中廣泛表達

為了理解我們的簇特異性標記如何與先前描述的韁核基因相關，本研究發(fā)現了三種基因表達模式。首先，一些已知基因顯示出與單個簇幾乎完全重疊，并且通過我們的分析也獨立地被鑒定為簇特異性標記。其次，一些已知標記韁核背側亞結構域的基因跨越了幾個簇。第三，大多數先前報道的韁核內區(qū)域表達模式的基因在多個簇。通過核糖核酸熒光原位雜交(FISH)驗證了這些經典標記與多個簇的重疊，證明了據報道空間受限的單個基因可以跨越多個神經元亞型。

此外，本研究對幼年和成年之間神經元類型的保留進行了探討，成功構建了相關單細胞基因表達圖譜。

 

3、Single-Cell Transcriptomics Analyses of Neural Stem Cell Heterogeneity and Contextual Plasticity in a Zebrafish Brain Model of Amyloid Toxicity

題目：斑馬魚淀粉樣蛋白毒性腦模型神經干細胞異質性和上下文可塑性的單細胞轉錄組學分析

發(fā)表雜志：Cell Reports 影響因子：8.032  發(fā)表日期：2019-4-23

 

 

 

研究內容概述：

斑馬魚大腦通過產生更多來自神經干細胞的神經元來對抗阿爾茨海默病。本研究通過使用單細胞測序技術，在成年斑馬魚大腦中識別出對阿爾茨海默病樣癥狀有不同反應的不同干細胞群，并開發(fā)出研究其分子機制的程序工具。

實驗材料：

表達GFP的轉基因斑馬魚用于分選祖細胞和端腦的其余部分。受精后6個月的雌魚用于分析。

實驗方法：

10x Genomics scRNA-Seq

實驗結論：

 

圖1、斑馬魚腦細胞分選和細胞類型歸類

1）單細胞轉錄組學揭示斑馬魚神經干細胞/神經膠質的異質性

2）不同的干細胞群可以在空間和分子層面上定義

3）Amyloid-b-42和白細胞介素-4誘導某些祖細胞群體的可塑性

4）相互作用圖譜預測調節(jié)神經干細胞可塑性的途徑

 

4、Developmental Diversification of Cortical Inhibitory Interneurons

題目：皮層抑制中間神經元的發(fā)育多樣化

發(fā)表雜志：Nature 影響因子：41.577  發(fā)表日期：2018-5-22

 

 

研究內容概述：

皮質中間神經元的不同子集在高階大腦功能中起著至關重要的作用。為了研究這種多樣性是如何產生的，本研究使用scRNA-Seq來描述在發(fā)育過程中的小鼠腦細胞轉錄組。

實驗材料：

野生型和轉基因雄性及雌性小鼠。

實驗方法：

10x Genomics scRNA-Seq，SMART-seq2等。

實驗結果及結論：

神經節(jié)突起中有絲分裂祖細胞的異質性是由高度保守的成熟軌跡驅動的，同時突起特異性轉錄因子的表達孕育了后來多樣性的出現。在有絲分裂后，祖細胞分化并分化成轉錄上不同的狀態(tài)，包括中間神經元前體狀態(tài)。通過跨發(fā)育時間點整合數據集，發(fā)現了成體中間神經元及其前體之間轉錄組異質性的共同來源，并揭示了主要中間神經元亞型的胚胎出現。本研究分析顯示，轉錄因子Mef2c與各種神經精神和神經發(fā)育障礙相關，描述了表達細小白蛋白的神經元的早期前體，對其發(fā)育至關重要。這些發(fā)現為早期抑制前體的分子多樣性提供了新的線索，并確定了可能影響人類中間神經元亞型的基因模塊。

 

圖1、小鼠神經節(jié)單細胞轉錄組測序圖譜

 

5、A Single-Cell Transcriptional Atlas of the Developing Murine Cerebellum

題目：發(fā)育中的小鼠小腦單細胞轉錄圖譜

發(fā)表雜志：Current Biology 影響因子：8.851  發(fā)表日期：2018-9-24

 

研究內容概述：

小腦由數量有限的細胞類型發(fā)展而來，這些細胞類型精確地組織形成控制感覺-運動協調和一些高階認知過程。本研究創(chuàng)建了發(fā)育中的鼠小腦單細胞轉錄圖譜，由來自12個時間點的39245個細胞組成。主要小腦譜系被鑒定，已知的和新的假定轉錄調節(jié)因子也被鑒定。數據集被集成到基于網絡界面Cell Seek中用于交互式探索。

實驗材料與方法：

對小鼠發(fā)育過程12個時間點小腦組織進行分離。這些時間點包括小鼠出生前每天間隔的八個e10和e17胚胎時間點以及出生后的P0、P4、P7和P10四個時間點的腦組織樣本。對于胚胎時間點，同一窩的小腦在每個實驗中被組合，而出生后的時間點每窩只使用一只幼鼠。每個時間點使用兩個獨立的重復進行。小腦在木瓜蛋白酶溶液中解離30分鐘，在Neurobasal中沖洗，并用40微米過濾器過濾。細胞用0.4% BSA的PBS中重懸。用LUNA自動細胞計數器對用Acridine Orange/Propidium Iodide染色的細胞濃度和生存力進行評估，之后進行標準的 10x Genomics scRNA-Seq檢測分析。

 

實驗結果及結論：

本研究在12個關鍵發(fā)育時間點對39245個小鼠小腦細胞進行了scRNA-Seq。使用公認的譜系標記，證實單細胞數據準確地概括了小腦的發(fā)育。然后通過遷移和分化跟蹤不同群體的出現，并確定相關的轉錄級聯。在確定關鍵譜系承諾決策后，集中分析揭示了在這些分支點轉錄因子表達的波動。最后，創(chuàng)建了Cell Seek，這是一個靈活的在線界面，有助于數據集的探索。本研究提供了單細胞分辨率下小腦發(fā)育的轉錄總結，這將為小腦發(fā)育、神經生物學和疾病的未來研究提供有價值的資源。

 

 

 

關于天昊

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