單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：一定程度上解決單細(xì)胞樣本處理難度

發(fā)稿時(shí)間：2019-06-03來(lái)源：天昊生物

單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）已經(jīng)成為揭示復(fù)雜組織中細(xì)胞類型、動(dòng)態(tài)狀態(tài)及功能過(guò)程的一項(xiàng)重要工具，然而從新鮮組織中制備單細(xì)胞懸液的嚴(yán)格要求對(duì)于已收集（凍存）的樣本或難以解離的樣本來(lái)說(shuō)是一大障礙。例如腦組織樣本需要嚴(yán)格的酶消化過(guò)程，但是這個(gè)過(guò)程損害了神經(jīng)元細(xì)胞RNA的完整度，使得恢復(fù)的細(xì)胞類型比例具有偏倚性，同時(shí)只適合來(lái)源于年輕個(gè)體的樣本，對(duì)于神經(jīng)退行性疾病已故患者的樣本無(wú)法更好地利用。為了解決這樣一些問(wèn)題，前幾年不同的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了從新鮮或者凍存樣本中分離單個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行RNA研究，如sNuc-Seq, Div-Seq等方法¹。然而這些方法依賴FACS將核分選進(jìn)96孔板、384孔板或C1微流控系統(tǒng)，無(wú)法解決成千上萬(wàn)個(gè)核或更大樣本量的分選工作。而大規(guī)模并行的scRNA-seq方法如Drop-seq等能夠很好地解決細(xì)胞通量的問(wèn)題²。

在這樣的背景下，2017年Broad研究所的科研團(tuán)隊(duì)（牛人科學(xué)家張鋒）在《Nature Methods》上發(fā)表了DroNc-seq的方法²，結(jié)合了單核測(cè)序（sNuc-seq）和Drop-seq的優(yōu)勢(shì)，比較完美地解決了上述問(wèn)題，同時(shí)應(yīng)用在小鼠和人凍存的腦組織樣本上能夠成功地分辨細(xì)胞類型及亞型、更容易發(fā)現(xiàn)罕見細(xì)胞、揭示表達(dá)特征和激活的通路等。單核轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也具有高度相關(guān)性、相似的通量和靈敏度，核的聚類主要依據(jù)細(xì)胞類型而不依賴個(gè)體，因此從應(yīng)用范圍上看，DroNc-seq對(duì)于難以處理的樣本或凍存的樣本的單細(xì)胞研究將是一大福利！

同樣地，10x Genomics公司的Chromium系統(tǒng)也能較好地應(yīng)用于單細(xì)胞核樣本的建庫(kù)中，相關(guān)的樣本制備資料可以從10x Genomics官網(wǎng)的Support信息中找到（https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing）。其中也是以小鼠和成人的腦組織為例做了核分離的說(shuō)明，由此也能看出單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序確實(shí)很適合神經(jīng)組織樣本。

除了神經(jīng)組織樣本，在腎臟組織領(lǐng)域研究人員還特別比較了幾種單核轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組方法³，包括利用Drop-seq進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq），分別利用Drop-seq、DroNc-seq和10x Chromium進(jìn)行單核RNA測(cè)序（snRNA-seq），發(fā)現(xiàn)在scRNA-seq中腎小球細(xì)胞類型是缺失的，而一類細(xì)胞可能因?yàn)槿藶榈慕M織解離（誘導(dǎo)的壓力反應(yīng)基因）而出現(xiàn)。而三種平臺(tái)的snRNA-seq中能夠發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞（glomerular podocytes）、系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，沒(méi)有壓力反應(yīng)相關(guān)的基因被檢測(cè)。當(dāng)前的snRNA-seq能夠比以往的scRNA-seq發(fā)現(xiàn)20倍更多的足細(xì)胞。而且他們?cè)谟贸Ｒ?guī)的scRNA方法對(duì)健康的腎組織沒(méi)有很好地完成建庫(kù)，但用snRNA方法實(shí)現(xiàn)了替代⁴。因此snRNA-seq與scRNA-seq相比具有同樣的基因檢測(cè)能力，而且有更大的優(yōu)勢(shì)，能夠減少組織解離引起的bias，適用于凍存樣本，消除組織解離時(shí)產(chǎn)生的壓力反應(yīng)。

此外從pubmed檢索中發(fā)現(xiàn)還有將snRNA-seq應(yīng)用于乳腺癌樣本和心臟樣本中同樣都獲得了較好的結(jié)果^5,6！

如果您有不適合進(jìn)行常規(guī)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣本，可以嘗試用單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序rescue下，或者利用您的樣本進(jìn)行scRNA-seq和snRNA-seq的對(duì)比，本身這也是發(fā)表文章的一個(gè)idea！

1. Habib N, Li Y, Heidenreich M, et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science 2016;353:925-8.

2. Habib N, Avraham-Davidi I, Basu A, et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature methods 2017;14:955-8.

3. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 2019;30:23-32.

4. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, et al. Single-Cell Transcriptomics of a Human Kidney Allograft Biopsy Specimen Defines a Diverse Inflammatory Response. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 2018;29:2069-80.

5. Gao R, Kim C, Sei E, et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature communications 2017;8:228.

6. Hu P, Liu J, Zhao J, et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes & development 2018;32:1344-57.