單核轉(zhuǎn)錄組測序：一定程度上解決單細胞樣本處理難度

發(fā)稿時間：2019-06-03來源：天昊生物

單細胞RNA測序（scRNA-seq）已經(jīng)成為揭示復雜組織中細胞類型、動態(tài)狀態(tài)及功能過程的一項重要工具，然而從新鮮組織中制備單細胞懸液的嚴格要求對于已收集（凍存）的樣本或難以解離的樣本來說是一大障礙。例如腦組織樣本需要嚴格的酶消化過程，但是這個過程損害了神經(jīng)元細胞RNA的完整度，使得恢復的細胞類型比例具有偏倚性，同時只適合來源于年輕個體的樣本，對于神經(jīng)退行性疾病已故患者的樣本無法更好地利用。為了解決這樣一些問題，前幾年不同的研究團隊開發(fā)了從新鮮或者凍存樣本中分離單個細胞核進行RNA研究，如sNuc-Seq, Div-Seq等方法¹。然而這些方法依賴FACS將核分選進96孔板、384孔板或C1微流控系統(tǒng)，無法解決成千上萬個核或更大樣本量的分選工作。而大規(guī)模并行的scRNA-seq方法如Drop-seq等能夠很好地解決細胞通量的問題²。

在這樣的背景下，2017年Broad研究所的科研團隊（牛人科學家張鋒）在《Nature Methods》上發(fā)表了DroNc-seq的方法²，結(jié)合了單核測序（sNuc-seq）和Drop-seq的優(yōu)勢，比較完美地解決了上述問題，同時應用在小鼠和人凍存的腦組織樣本上能夠成功地分辨細胞類型及亞型、更容易發(fā)現(xiàn)罕見細胞、揭示表達特征和激活的通路等。單核轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)與單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也具有高度相關(guān)性、相似的通量和靈敏度，核的聚類主要依據(jù)細胞類型而不依賴個體，因此從應用范圍上看，DroNc-seq對于難以處理的樣本或凍存的樣本的單細胞研究將是一大福利！

同樣地，10x Genomics公司的Chromium系統(tǒng)也能較好地應用于單細胞核樣本的建庫中，相關(guān)的樣本制備資料可以從10x Genomics官網(wǎng)的Support信息中找到（https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing）。其中也是以小鼠和成人的腦組織為例做了核分離的說明，由此也能看出單核轉(zhuǎn)錄組測序確實很適合神經(jīng)組織樣本。

除了神經(jīng)組織樣本，在腎臟組織領(lǐng)域研究人員還特別比較了幾種單核轉(zhuǎn)錄組和單細胞轉(zhuǎn)錄組方法³，包括利用Drop-seq進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），分別利用Drop-seq、DroNc-seq和10x Chromium進行單核RNA測序（snRNA-seq），發(fā)現(xiàn)在scRNA-seq中腎小球細胞類型是缺失的，而一類細胞可能因為人為的組織解離（誘導的壓力反應基因）而出現(xiàn)。而三種平臺的snRNA-seq中能夠發(fā)現(xiàn)腎小球足細胞（glomerular podocytes）、系膜細胞及內(nèi)皮細胞，沒有壓力反應相關(guān)的基因被檢測。當前的snRNA-seq能夠比以往的scRNA-seq發(fā)現(xiàn)20倍更多的足細胞。而且他們在用常規(guī)的scRNA方法對健康的腎組織沒有很好地完成建庫，但用snRNA方法實現(xiàn)了替代⁴。因此snRNA-seq與scRNA-seq相比具有同樣的基因檢測能力，而且有更大的優(yōu)勢，能夠減少組織解離引起的bias，適用于凍存樣本，消除組織解離時產(chǎn)生的壓力反應。

此外從pubmed檢索中發(fā)現(xiàn)還有將snRNA-seq應用于乳腺癌樣本和心臟樣本中同樣都獲得了較好的結(jié)果^5,6！

如果您有不適合進行常規(guī)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的樣本，可以嘗試用單核轉(zhuǎn)錄組測序rescue下，或者利用您的樣本進行scRNA-seq和snRNA-seq的對比，本身這也是發(fā)表文章的一個idea！

1. Habib N, Li Y, Heidenreich M, et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science 2016;353:925-8.

2. Habib N, Avraham-Davidi I, Basu A, et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature methods 2017;14:955-8.

3. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 2019;30:23-32.

4. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, et al. Single-Cell Transcriptomics of a Human Kidney Allograft Biopsy Specimen Defines a Diverse Inflammatory Response. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 2018;29:2069-80.

5. Gao R, Kim C, Sei E, et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature communications 2017;8:228.

6. Hu P, Liu J, Zhao J, et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes & development 2018;32:1344-57.