祝賀！天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術助力客戶登陸Science of the Total Environment

發(fā)稿時間：2019-07-01來源：天昊生物

 

南京農業(yè)大學陳巍課題組近期在《Science of the Total Environment》上發(fā)表了高通量微生物絕對定量測序揭示不同施肥應用對種植番茄的濱海鹽漬土壤細菌群落的影響的文章。在這項研究中使用了天昊生物創(chuàng)新型的的微生物16S擴增子絕對定量測序技術。在恭喜客戶發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：High-throughput absolute quantification sequencing reveals the effect of different fertilizer applications on bacterial community in a tomato cultivated coastal saline soil

中文題目：高通量微生物絕對定量測序揭示不同施肥應用對種植番茄的濱海鹽漬土壤細菌群落的影響

期刊名：Science of the Total Environment    

影響因子： 5.589

研究概要：

濱海鹽漬土是一種重要的后備土地資源，具有很高的農業(yè)利用潛力。本研究采用高通量微生物16S絕對定量方法，研究了4種不同施肥方式（100%生物有機肥、70%生物有機肥和30%化肥、30%生物有機肥和70%化肥、100%化學肥）對番茄鹽漬土壤細菌群落組成的影響。田間試驗結果表明，70%生物有機肥加30%化肥是沿海灘涂地區(qū)發(fā)展番茄栽培（提高產量和果實品質）的最佳劑量。盆栽試驗對番茄的生長也有類似的結果，同時表明70%生物有機肥加30%化學肥料對土壤微生物群的活化效果最好。肥料對土壤養(yǎng)分的輸入增加了細菌的總豐度（比初始土壤增加了3倍），同時導致土壤中細菌多樣性的顯著喪失。其中以變形桿菌、擬桿菌和厚壁菌為主的門是微生物群落轉變的主要原因，特別是在70%生物有機肥和100%化肥處理的土壤中，其富集程度顯著。RDA和皮爾遜相關分析表明，土壤養(yǎng)分，特別是有效磷、有效鉀和土壤鹽分是影響該生態(tài)系統(tǒng)細菌群落的主要環(huán)境因子，但有機質含量和土壤酸堿度也在微生物群落的組裝中起著重要作用。

研究背景：

鹽漬土在世界范圍內廣泛分布，占地球表面的8%。我國鹽漬土總面積為3.67×10⁷ha，其中30%具有農業(yè)利用價值。濱海鹽漬土是鹽漬土的一個亞類，是江蘇省重要的潛在土地資源。中國沿海總面積2.17×10⁶ha，其中95%為潮間帶，江蘇約占1/4。此外，由于黃河和長江的大量泥沙淤積，該地區(qū)的灘涂以每年50-200米的速度擴張。因此，沿海鹽漬土（灘涂地區(qū)）被認為是農業(yè)發(fā)展的儲備地，具有很大的潛力，可以緩解我國土地資源不足的壓力。

然而，沿海灘涂地區(qū)由于其高鹽度，通過高滲透脅迫、營養(yǎng)缺乏、毒性和不良的物理土壤條件抑制了大部分作物，因此沿海灘涂地區(qū)通常具有植物生長不良和微生物活性低的特點。因此，除了培育耐鹽植物品種外，還需要可持續(xù)的生物技術來提高沿海鹽土的質量，特別是那些通過植物根系和微生物群之間的互作來發(fā)揮作用的技術。為了提高土壤肥力和作物產量，人們嘗試了各種技術來改良沿海鹽漬土，包括化學、物理、生物和工程改良。例如，Liu等人（2015）發(fā)現(xiàn)，在牛糞、石膏和一種新的改良劑產品的應用中，牛糞通過引入豐富的有機質（OM），從而提高土壤微生物活性，在改善濱海鹽土性質方面取得了富有希望的成果。此外，Chen等人（2016）的研究表明，施用富含真菌木霉菌的生物有機肥可使鹽地堿蓬的生長量增加83%，并顯著改變土壤微生物生物量。顯然，有機堆肥或生物功能性有機肥與不同比例的化肥的結合在這一領域受到越來越多的關注。在農業(yè)中，富含有益微生物的有機生物肥與化肥的結合使用，是提高土壤肥力，增加土壤有機質、孔隙、持水能力和微生物活性，同時減少化肥施用總量（可能導致沿海生態(tài)系統(tǒng)次生鹽堿化）的一種很有前景的途徑。

土壤微生物群落在調節(jié)植物耐鹽性和提高鹽漬土壤質量中起著關鍵作用。然而，對于微生物群對鹽漬土中外源添加的反應，尤其是在這種情況下細菌群落的裝配動力學，人們知之甚少。在過去的十年中，高通量測序極大地擴大了我們對不同生態(tài)系統(tǒng)中細菌群落的理解，雖然這種方法對于確定樣本中不同微生物類群的相對豐度很有價值，但是它并不能準確提供不同樣本間目標微生物豐度差異的信息。最近，研究人員開始使用絕對定量16S rRNA測序方法來解決這一領域的技術挑戰(zhàn)。本研究的目的是：1）用微生物絕對定量方法揭示不同施肥條件下鹽漬土細菌群落的變化，揭示土壤微生物組成與土壤化學性質的關系。2）在番茄盆栽和田間試驗的基礎上，確定沿海鹽漬土生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)農業(yè)發(fā)展的最佳施肥量。

田間試驗場地及設計：

野外試驗場位于江蘇省大豐市的潮坪地區(qū)，面對黃海，該地區(qū)屬北亞熱帶季風氣候，四季分明，年平均降雨量1058毫米，年平均氣溫15°C，年平均日照2280小時，具有典型的濱海鹽漬土。本研究所采用的肥料為商業(yè)化生物有機肥（雞糞中添加10⁷孢子/g 的植物益生菌木霉菌NJAU 4742），化肥包括尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。設計了以下田間施肥處理：1）100%生物有機肥（100BF），2）70%生物有機肥和30%化肥（70BF），3）30%生物有機肥和70%化肥（30BF），4）100%化肥（CF）。每種施肥方式都有五個重復地塊，每個地塊為8.0 m²（4.0 m×2.0 m），長有21株4周齡的番茄幼苗。在2018年期間，番茄植株生長100天，并記錄了有關番茄產量數(shù)據，五個植株（帶水果）被從地里轉移到實驗室。

盆栽試驗設計：

為了更有效地研究不同施肥對鹽漬土微生物群的影響，從田間試驗相同區(qū)域（0-20cm深）采集了200kg的土壤，并轉移到玻璃房進行盆栽試驗。盆栽試驗進行了兩次，施肥處理與田間試驗相同。每種處理有5個盆栽，每個盆栽含有2.8kg的土壤和1個番茄幼苗。在自然光條件下，隨機放置在20-30°C的玻璃室內。種植后第42天，按照上述田間試驗方法采集植物樣本，土壤樣本在同一天從每個盆栽中采集。

樣品制備和分析：

測定土壤化學性質，包括土壤鹽漬度、土壤pH值、總磷、總鉀、硝態(tài)氮、有效磷和有效鉀。在田間試驗和盆栽試驗中，對每株植物的株高和莖粗進行人工記錄，然后對植物樣品（莖和根）進行干燥，以測量干重和進行營養(yǎng)分析（如測定番茄果實中的維生素C含量、NO3-含量、總蛋白質含量和可溶性糖含量）。

16S擴增子絕對定量測序：

為了觀察施肥前后土壤微生物群的變化，未施肥初始土壤樣品也被納入分析。因此從盆栽試驗的四個處理（CF、30BF、70BF和100BF）中收集的20個土壤樣品加上5個初始土壤樣品被送往上海天昊生物科技有限公司進行細菌16S擴增子絕對定量測序（V4-V5區(qū)域）。

 

研究結果：

田間試驗番茄產量與品質

•  鹽漬地番茄產量和果實品質受施肥影響較大（表1）。在四種施肥方式中，70BF處理的番茄產量顯著最高。70BF處理使番茄產量分別比CF、30BF和100BF提高了17.2%、25.9%和23.6%。經生物有機肥（BF）處理的番茄（30BF、70BF、100BF）其蛋白質含量隨生物有機肥施用量的增加呈增長趨勢，而果實中硝酸鹽的積累呈相反的趨勢。四種處理間可溶性糖積累無顯著性差異。生物有機肥（BF）處理的番茄根系生長量比化肥（CF）處理的番茄根系生長量增加，表現(xiàn)為根系干生物量。

 

 表1田間試驗中不同處理對番茄產量、品質及根系生長的影響

•  此外，表2中所示的番茄植株生長和營養(yǎng)特性表明，生物有機肥施用（30BF、70BF、100BF）比化肥（CF）處理的植株生長更好，磷吸收更高。在三種BF處理中，70BF和100BF處理的株高顯著高于30BF。

 

表2田間試驗中不同處理對番茄植株生長和營養(yǎng)的影響

盆栽試驗中番茄生長及土壤性狀的研究

•   盆栽試驗中番茄幼苗的生長（表3）證實了田間四種施肥方式對番茄生長影響的結果。此外，盆栽試驗中30BF和CF處理的根系生長（以根系干重表示）比田間試驗增加更顯著，而四種處理之間的莖徑無顯著差異。

 

表3盆栽試驗中不同處理對番茄植株生長和營養(yǎng)的影響

• 同時，與初始未施肥土壤（CK）相比，四種施肥方式對土壤化學性質的影響有顯著性差異（圖1）。具體來說，土壤中的酸堿度、硝酸鹽氮和有效鉀(AK)呈明顯的下降趨勢，按CF>30BF>70BF>100BF的順序排列。經生物有機肥（BF）改良后的土壤中的OM和有效磷(AP)明顯高于CF處理后的土壤和CK土壤。施肥土壤中的陽離子量（以ECe值表示），相對于對照樣品中的陽離子量，無論肥料輸入的形式如何，累積了3.3-3.8倍。

 

圖1盆栽試驗中不同施肥處理對土壤化學性質的影響

土壤細菌群落的絕對定量

• 清除模糊、低質量序列和singleton OTU后，25個土壤樣本共得到5,282,236條reads（含Spike-in序列），每個樣本生成的OTU數(shù)量從3124到4252不等，并由RDP數(shù)據庫進一步分類。生成的OTU的維恩圖顯示了核心微生物群，所有樣本中共享3331個OTU。根據Spike-in生成的標準曲線進行微生物絕對定量。

•  每克土壤的估計絕對拷貝數(shù)如圖2a所示，相應的門水平相對豐度如圖2b所示。與未施肥的初始樣品（CK）相比，經過肥料處理的樣品中細菌的總豐度增加了2.6-3.8倍，70BF樣品中細菌的總豐度顯著最高，其次是CF樣品。所有測試樣品中以Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Actinobacteria, Firmicutes, Planctomycetes, Acidobacteria為優(yōu)勢菌門。

 

圖2 所有土壤樣品中主要細菌門的絕對豐度（A，每克土壤中16S rRNA基因拷貝數(shù)）和相對豐度（B，%）。

•  四種處理的土壤中細菌種類對施肥量的響應不同，形成了具有不同α多樣性指數(shù)的群落（表S1），盡管施肥處理后的土壤細菌總數(shù)顯著增加，但這些樣品（CF、30BF、70BF和100BF）中的細菌多樣性較未處理土壤樣品（CK）明顯降低，其中，CF處理導致細菌多樣性的損失最大（顯示最低香農值的多樣性）。
• 根據PCoA（按Bray Curtis計算，如圖3a所示）和平均連鎖層次聚類（UPGMA，按Bray Curtis計算，如圖3b所示），用PCo1（53.64%）將初始土壤（CK）的細菌群落與四種施肥土壤的細菌群落明顯分離；用PCo2（29.66%）將CF處理土壤的細菌群落與BF處理土壤的細菌群落明顯分離，相比之下，兩個較高的BF處理（70BF和100BF）不能清楚地彼此分離。

 

圖3 細菌群落的主坐標分析（A，PCoA）和層次聚類樹（B）（以Bray Curtis計算）

•  屬水平上進行的熱圖分析（圖4）也顯示細菌群落組成的集群模式與PCoA觀察到的集群模式相似。在施肥處理（CF和BF系列）中，大多數(shù)被選的菌屬（前100個）的絕對豐度明顯高于CK土壤，如圖所示，紅色/橙色柱狀物更多。此外，BF系列土壤的細菌組成比CF土壤中的細菌組成更均勻，如顏色強度所示。

 

圖4 土壤樣品中100個最豐富細菌屬的熱圖分析

 

細菌群落與土壤化學屬性的關系

• 為了確定影響本研究鹽漬土壤細菌群落組成的因素，進行了RDA（圖5）和Pearson相關分析。土壤樣本根據門水平細菌群落組成分為三組（圖5）。第一組分（RDA1）從肥料處理樣品（CF和BF系列）中分離出初始土壤樣品（CK），解釋了70.59%的變化。第二組分（RDA 2）僅解釋了18.98%的變異，并從BF系列樣品中分離出了CF樣品。土壤酸堿度與大多數(shù)優(yōu)勢種呈負相關，其它5個土壤參數(shù)（包括土壤OM、EC、硝酸鹽N、有效磷和有效鉀）與細菌豐度呈正相關（圖5）。例如，肥料處理土壤中的Bacteroidetes和 Proteobacteria含量較高，與土壤EC含量較高呈正相關。有趣的是，在六個試驗土壤參數(shù)中，土壤中的HE-OM比其他五個參數(shù)的重要性要小。而土壤養(yǎng)分有效性參數(shù)如有效磷、有效鉀、硝酸鹽N、土壤ECe對鹽漬土微生物群落的驅動作用較強。

圖5  RDA確定了構成細菌群落的六個選定環(huán)境變量。

•  此外，還計算了番茄根系生長與屬水平細菌絕對豐度的皮爾遜相關系數(shù)。根生物量與前30個屬中的15個（包括一些重要的屬，如Pseudomonas假單胞菌和Sphingopyxis）呈正相關，還包括5個屬（Gp6、Sphingomonas鞘膜單胞菌、Chitinophaga、Rhizobium根瘤菌和Flavisolibacter），這些屬只有在加載有機物后才會富集。