又一篇！天昊生物微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)再發(fā)好文

發(fā)稿時間：2019-10-23來源：天昊生物

濰坊醫(yī)學(xué)院楊潔教授課題組近期在《Carbohydrate Polymers》上發(fā)表了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素的鏈構(gòu)象、理化性質(zhì)及其體外發(fā)酵的文章。在這項研究中使用了天昊生物創(chuàng)新型的的微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)。在恭喜客戶發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Chain conformation, physicochemical properties of fucosylated chondroitin

sulfate from sea cucumber Stichopus chloronotus and its in vitro fermentation by human gut microbiota

中文題目：綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素的鏈構(gòu)象、理化性質(zhì)及其體外發(fā)酵

期刊名：Carbohydrate Polymers 

影響因子： 6.044

研究概要

本文采用HPSEC-MALLS和worm-like cylinder模型方法研究了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc)的鏈構(gòu)象和理化性質(zhì)，同時通過16S擴增子絕對定量測序研究它對人體腸道菌群的影響。結(jié)果表明綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc) 在PBS中采用剛性棒狀鏈構(gòu)象，鏈構(gòu)象參數(shù)分別為α_η（1.11）和α_h（0.70）。從worm-like cylinder模型推導(dǎo)出的剛度參數(shù)表明fCS-Sc表現(xiàn)為剛性鏈。剛果紅分析顯示為單螺旋結(jié)構(gòu)。fCS-Sc在較寬的ph范圍內(nèi)表現(xiàn)出負的zeta電位和良好的熱穩(wěn)定性。此外，fCS-Sc還可以通過提高腸道菌群的絕對豐度來調(diào)節(jié)腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)，例如增加有益菌Megamonas、Bacteroides、Fusobacterium、Parabacteroides、Prevotella、Faecalibacterium，抑制病原微生物，從而促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。本研究進一步加深了對fCS-Sc空間結(jié)構(gòu)的認識，以及fCS-Sc作為益生元的應(yīng)用。

研究背景

巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS）是從海參中提取的一種獨特的天然硫酸軟骨素類似物，含有硫酸巖藻糖支鏈。從不同海參中獲得的巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS）結(jié)構(gòu)各不相同。不同種類海參的fCS具有相似的硫酸軟骨素骨架結(jié)構(gòu)和不同硫酸基取代的巖藻糖分支。巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS）因其多種生物活性而受到廣泛關(guān)注，它具有明顯的抗凝、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抗病毒、改善高血糖等作用。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)如單糖組成、糖苷結(jié)構(gòu)、取代基、分子量和鏈構(gòu)象對其活性有明顯的影響。HPSEC-MALLS技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多糖鏈構(gòu)象的測定。近年來人們利用SEC-MALLS方法對fCS的鏈構(gòu)象進行了研究。從刺參Apostichopus japonicus中提取的fCS在0.15 M NaCl（ph 7.4）中具有隨機的線圈結(jié)構(gòu)。在0.2M的NaCl溶液中， Isostichopus badionotus和Pearsonothuria graeffei 的fCS具有隨機的螺旋構(gòu)象。然而，從綠刺參中分離得到的fCS的鏈構(gòu)象還沒有研究。

近年來，生物活性多糖的益生元功能受到了廣泛關(guān)注。腸道菌群作為一種功能器官，在人類健康與宿主飲食的相互作用中發(fā)揮著重要作用。同時，闡明益生元組分與腸道菌群之間的聯(lián)系有助于其作為功能性食品的應(yīng)用。由于人類消化系統(tǒng)不能產(chǎn)生足夠的碳水化合物水解酶，腸道微生物群在多糖代謝中發(fā)揮著重要作用。腸道微生物群降解多糖，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs，如乙酸、丙酸和丁酸），在維持上皮屏障功能、調(diào)節(jié)上皮細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能、預(yù)防結(jié)直腸癌等方面發(fā)揮重要作用。在我們之前的研究中，我們從綠刺參中獲得了一種巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS-Sc），并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了表征研究。為進一步闡明其構(gòu)效關(guān)系，采用HPSEC-MALLS方法對鏈構(gòu)象進行了測定，并worm-like cylinder模型方法進行了進一步的解釋，研究了zeta電位和熱穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)，同時也是首次對fCS-Sc的體外發(fā)酵進行了研究。

研究方法

fCS-Sc體外發(fā)酵：

根據(jù)文獻報道，對fCS-Sc進行了體外發(fā)酵研究。將fCS-Sc或低聚果糖（FOS，陽性對照）溶于培養(yǎng)基中（10mg/ml），高壓滅菌。新鮮糞便樣本來自三名自愿捐贈者（兩名女性和一名男性，年齡25-35歲），他們在三個月內(nèi)沒有胃腸道疾病或抗生素治療。將每個供者的相同量糞便樣本混合，用PBS稀釋成10%（w/v）的糞漿，以500rpm離心5min，除去食物殘渣。然后，將9ml空白培養(yǎng)基（對照組）或含fCS-Sc或FOS的培養(yǎng)基與1ml糞漿混合。將混合物立即放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，37℃孵育24小時。在Silgreen陽離子交換柱（300×7.8mm）上分析培養(yǎng)基中的SCFAs含量，用8mM H₂ SO₄洗脫，215nm檢測。

16S擴增子絕對定量測序：

使用FastDNA? SPIN Kit (MP Biomedicals, LLC, USA)提取樣本微生物基因組DNA，然后在上海天昊生物科技有限公司進行16S擴增子絕對定量測序（V3-V4）。

研究結(jié)果

fCS-Sc的理化性質(zhì)

HPSEC-MALLS-Visc-RI結(jié)果表明，fCS-Sc在PBS中呈剛性棒狀鏈構(gòu)象。M_w、[η]、R_h和構(gòu)象參數(shù)α_η和α_h分別為63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根據(jù)類蠕蟲柱體模型計算了更多的構(gòu)象參數(shù)，結(jié)果表明，M_L，q，d， C_∞分別為793g/mol?nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4，結(jié)果表明fCS-Sc具有一定的鏈剛度。剛果紅試驗表明，fCS-Sc具有高度有序的單螺旋結(jié)構(gòu)。fCS-Sc在較寬的ph范圍內(nèi)呈現(xiàn)負zeta電位，熱穩(wěn)定性較好。

fCS-Sc對腸道菌群的影響

采用新鮮人糞便體外發(fā)酵和高通量測序分析，研究fCS-Sc對腸道菌群的影響。9個樣品（3組，每組3個重復(fù)）共獲得3099052條原始序列。在對原始序列進行過濾并以97%的相似性進行聚類后，每個樣本獲得254±19個OTUs。樣本稀疏曲線和shannon曲線都表明測序深度覆蓋了最大的多樣性。不同組別產(chǎn)生的OTUs的venn圖顯示，所有組別共有246個OTUs。如表1所示，與對照組相比，fCS-Sc組的群落豐富度指數(shù)chao1和ACE指數(shù)顯著高于對照組。fCS-Sc組的群落多樣性指數(shù)（shannon指數(shù)）也明顯高于對照組，這些結(jié)果表明fCS-Sc能促進腸道微生物的豐富性和多樣性。

表1 不同組別的alpha多樣性

主坐標分析（PCoA）結(jié)果表明，fCS-Sc處理后，三組菌群的微生物組成有明顯的聚集性，微生物結(jié)構(gòu)有明顯的變化（圖5a）。上述結(jié)論也得到了OTUs水平Bray-Curtis聚類分析結(jié)果的證實（圖5b）

圖5 基于主坐標分析（a）、聚類分析（b）的微生物群落結(jié)構(gòu)差異研究

不同于以往對特定樣品中微生物相對豐度的研究，靶向微生物在不同樣品間的絕對豐度越來越受到關(guān)注。樣品中微生物群的絕對定量是通過添加spike-in序列及其生成的標準曲線來實現(xiàn)的。各細菌類群在門水平上的相對豐度和絕對拷貝數(shù)如圖6a所示，結(jié)果表明，隨著fCS-Sc和FOS的處理，微生物組成發(fā)生了明顯變化。尤其是fCS-Sc處理組的微生物絕對豐度是對照組的2.74倍，說明fCS-Sc是一種有效的益生元，能顯著促進腸道微生物的生長。此外，F(xiàn)OS能促進微生物群的生長，比對照組增加1.33倍。在門的水平上，腸道微生物群主要由Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Fusobacteria組成（圖6a）。厚壁菌/類桿菌比例 (F/B) 與高熱量飲食引起的肥胖密切相關(guān)，從圖6a可以看出，與對照組相比，fCS-Sc和FOS顯著降低了F/B比值，分別從6.83降至1.55和3.12（p<0.05），說明fCS-Sc通過降低厚壁菌/類桿菌比值來有利宿主健康。結(jié)果還表明，fCS-Sc的發(fā)酵主要是由擬桿菌和梭桿菌引起的。在屬水平上（圖6b），腸道菌群主要由Escherichia/Shigella、Clostridium_XlVa、Megamonas、Dialister、Bacteroides、Fusobacterium、Bifidobacterium等組成，與對照組相比，fCS-Sc和FOS處理組的腸道菌群組成有明顯變化，說明fCS-Sc和FOS能顯著促進某些不同種類腸道菌群的生長。

圖6 主要細菌在門（a）和屬（b）水平上的相對豐度和絕對豐度

為了進一步闡明不同組之間的細菌組成差異，三組的腸道微生物群的熱圖如圖7所示，人類腸道糞便中65種主要屬發(fā)現(xiàn)有顯著差異。將相對豐度低于1%的屬從類群中剔除后，選出17個屬進行比較，與對照組相比，fCS-Sc顯著增加了Megamonas（1.26倍）、Bacteroides（5.18倍）、Fusobacterium（13.3倍）、Parabacteroides（6.11倍）、Prevotella（21.0倍）、Faecalibacterium（17.0倍）的豐度，降低了Clostridium_XlVa、Bifidobacterium、Dialister、Enterobacter、Phascolarctobacterium、Dorea的豐度。Megamonas可以產(chǎn)生醋酸鹽來促進脂肪生成和膽固醇形成，它在FOS組中也有顯著的增加，如先前報道一樣。類桿菌是產(chǎn)生SCFAs的細菌，在維持微生物區(qū)系中起著重要的作用，可能與抗菌能力有關(guān)。Prevotella與難消化碳水化合物的水解有關(guān)，而且Prevotella增多可能會調(diào)節(jié)血糖，降低患糖尿病的風險。Bacteroides和Prevotella是兩種利用fCS-Sc的有益腸道菌群，而Clostridium_XlVa被認為是條件致病菌，Dorea被認為是促炎癥屬，這兩種菌在fCS-Sc組均明顯減少。這些研究結(jié)果表明，fCS-Sc通過增加有益菌的數(shù)量和抑制病原微生物對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。

圖7 屬水平腸道微生物組成的熱圖

發(fā)酵過程中產(chǎn)生的SCFAs

SCFAs（短鏈脂肪酸）是腸道菌群對不溶性多糖的主要發(fā)酵產(chǎn)物，對維持大腸正常功能和結(jié)腸上皮細胞形態(tài)具有重要作用。不同組別發(fā)酵24小時后的SCFAs含量見表2，結(jié)果表明，樣品中的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸、丙酸和異丁酸。fCS-Sc能明顯促進乙酸、丁酸和異戊酸的產(chǎn)生，另一方面，F(xiàn)OS處理使乙酸、丙酸含量顯著增加，異丁酸含量顯著降低。FOS組未檢測到丁酸和異戊酸。

表2 體外發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生

研究結(jié)論

HPSEC-MALLS-Visc-RI結(jié)果表明，fCS-Sc在PBS中呈剛性棒狀鏈構(gòu)象。M_w、[η]、R_h和構(gòu)象參數(shù)α_η和α_h分別為63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根據(jù)類蠕蟲柱體模型計算了更多的構(gòu)象參數(shù)，結(jié)果表明，M_L，q，d， C_∞分別為793g/mol?nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4，結(jié)果表明fCS-Sc具有一定的鏈剛度。剛果紅試驗表明，fCS-Sc具有高度有序的單螺旋結(jié)構(gòu)。fCS-Sc在較寬的ph范圍內(nèi)呈現(xiàn)負zeta電位，熱穩(wěn)定性較好。此外，fCS-Sc通過促進腸道菌群的豐富性和多樣性，促進有益細菌生長和SCFAs（短鏈脂肪酸）的產(chǎn)生，對腸道菌群有顯著的調(diào)節(jié)作用。本研究有助于了解fCSs的鏈構(gòu)象及其在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中的應(yīng)用。

常規(guī)擴增子測序和qPCR技術(shù)痛點

     常規(guī)16S擴增子測序技術(shù)雖然其具有高通量，低花費，可客觀還原菌群結(jié)構(gòu)及相對豐度比例的巨大優(yōu)勢，但是其是通過某一OTU分類單元的序列數(shù)所占總序列數(shù)的比值來獲得某個細菌的相對豐度比例信息，然而相對豐度信息不能反映樣本中物種真實的絕對豐度情況，例如微生物某一類群的相對豐度比例增加不一定真正是相應(yīng)微生物類群的絕對豐度增加，可能是其它微生物類群的絕對豐度減少是導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對豐度比例的增長，因此常規(guī)16S擴增子測序技術(shù)基于相對定量分析的錯誤結(jié)果解釋可能導(dǎo)致假定的因果關(guān)系！

         qPCR絕對定量技術(shù)雖然可以進行物種絕對定量分析，但是qPCR定量實驗結(jié)果常常不穩(wěn)定，且特定物種qPCR需要設(shè)計特定引物，對引物特異性要求較高，且引物優(yōu)化難度較大，導(dǎo)致常規(guī)的qPCR絕對定量實驗不再適用于組成較為復(fù)雜的環(huán)境樣本微生物絕對定量。此外，當環(huán)境樣本中往往含有腐殖酸，這些腐殖酸會通過抑制酶的活性抑制PCR，從而影響qPCR對細菌拷貝數(shù)定量結(jié)果的準確性。

天昊16S擴增子絕對定量測序技術(shù)簡介

該技術(shù)是一種將qPCR絕對定量技術(shù)和常規(guī)16S擴增子測序技術(shù)合二為一的技術(shù)，該技術(shù)不但可以進行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析、指標和微生物相關(guān)性分析等常規(guī)16S擴增子測序分析，關(guān)鍵可以解析樣本中總細菌的絕對拷貝數(shù)，還可以解析樣本中每個物種的絕對拷貝數(shù)，因而對微生態(tài)學(xué)內(nèi)許多懸而未決的問題具有進一步闡明的潛力。此外，該技術(shù)進行細菌拷貝數(shù)定量時，構(gòu)建標準曲線的內(nèi)標和樣本DNA是在同一個樣本孔中一起進行PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率相同，因此校正了腐殖酸對PCR的影響，避免了腐殖酸等PCR抑制物對樣品細菌16S拷貝數(shù)定量的影響，因此針對土壤、水體和淤泥等環(huán)境樣本，天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)計算得到的細菌16S拷貝數(shù)相對于qPCR更準確。

天昊16S擴增子絕對定量測序技術(shù)應(yīng)用情況

目前天昊微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)平臺已經(jīng)完成項目近百個，合作單位包括中國科學(xué)院微生物研究所、中國科學(xué)院南京土壤研究所、中國科學(xué)院水生生物研究所、同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院、廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城工學(xué)院、南京財經(jīng)大學(xué)、南京中醫(yī)藥大學(xué)、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院等多個單位，覆蓋環(huán)境土壤微生物，環(huán)境水體微生物和醫(yī)學(xué)腸道微生物等多個領(lǐng)域，利用該技術(shù)的項目文章成功發(fā)表在環(huán)境科學(xué)期刊《Science of the Total Environment》（IF= 5.589）和應(yīng)用化學(xué)1區(qū)期刊《Carbohydrate Polymers》（IF=6.044）上，目前該技術(shù)因其創(chuàng)新性、準確性和穩(wěn)定性受到客戶的廣泛好評！ 天昊生物目前是國內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴增子絕對定量測序”技術(shù)的服務(wù)商，熱烈歡迎各位老師與我們交流溝通！