【昊閱讀】miRNA在物種進化研究中的應用

發(fā)稿時間：2019-11-15來源：天昊生物

基因調控為基因功能的多樣化和物種形成之間提供了一種關鍵的聯(lián)系，但像miRNAs等許多基因調控機制是怎樣在快速多樣化的群體中起作用的仍不夠清楚。最近在Mol. Biol. Evol.雜志上發(fā)表了一篇研究火山口湖泊中慈鯛幼魚miRNA基因調控及其適應性的研究，揭示了物種進化的分子機制。

 

題目：火山口湖泊中慈鯛幼魚miRNA基因調控及平行適應性輻射研究

發(fā)表期刊：Mol. Biol. Evol.  發(fā)表時間：2019-8-9  影響因子：14.797

 

 

歷史上，研究適應性進化分子機制的研究曾多集中在蛋白質編碼序列變異上。然而，自從1969布里頓和戴維森Science文章“Gene regulation for higher cells—a theory”的發(fā)表以來，基因調控越來越被認為是物種分化的主要驅動力之一。現(xiàn)在，基因調控被廣泛認為是適應性進化的最快和最有效的機制之一，并被認為在物種形成的初始階段特別重要。盡管在廣泛表達的蛋白質編碼序列中的非同步性變化可以對表型產生主要的多效性影響，基因調控機制，如轉錄因子、DNA甲基化和miRNAs可以產生更精細的結果。通過對基因的調控更有利于適應和潛在生殖隔離，甚至在面對基因流時也能為遺傳分化奠定基礎。

 

研究已經表明，miRNAs可以通過與mRNAs的靶向結合，通過mRNAs切割和/或翻譯抑制直接下調基因表達。此外，miRNAs已被證明能調節(jié)許多參與細胞分化、細胞命運決定、增殖和組織發(fā)育等不同過程的蛋白質。作為轉錄后基因表達的基本調節(jié)因子，miRNAs也可以促進環(huán)境適應、表型多樣化和物種形成。大多數(shù)蛋白質編碼基因由miRNAs調控，miRNAs的表達通常受到嚴格的時空控制。此外，當存在各自的結合位點時，單個基因可以由多個miRNAs調節(jié)。在動物中，通常這些成熟的miRNAs是通過其5’端種子區(qū)與轉錄mRNA的3’ UTRs區(qū)域堿基互補配對的。然而，前體miRNA序列可以存在于基因組中的任何地方，這使得miRNAs在面對基因流的均質化效應時，對于適應和物種形成具有特殊的意義。

 

本研究利用尼加拉瓜火山口湖泊中快速多樣化的慈鯛魚類 (Amphilophus spp.)，研究了miRNAs在其轉錄后的調節(jié)作用。研究者通過對五種慈鯛魚類物種胚胎的miRNA和mRNA測序，在mRNAs中鑒定了miRNA結合位點，并強調了在這些適應性輻射物種中存在數(shù)量驚人的新miRNA。然后，通過對表達水平的分析，研究確定了推定的表達水平呈負相關的miRNA/基因靶對，它們與miRNA在下調基因中的作用一致。此外，研究者確定的幾個miRNAs/基因對顯示出與海底/湖沼同域物種分化相關的表達模式，暗示這些miRNAs是同域分化潛在的分子機制。最后，由于這些候選miRNA/基因對可能在這些慈鯛魚的表型多樣化中發(fā)揮中心作用，研究者通過原位雜交來表征所選miRNA及其靶基因的表達，進一步證明miRNA調節(jié)可能在慈鯛魚類的適應性輻射中發(fā)揮作用。這些結果表明，快速進化的miRNA調節(jié)作用即便在基因流存在的情況下也會對物種的快速進化分歧具有重要作用。

 

 

材料和方法

 

本研究使用5個魚類物種1天齡15個樣本(每個物種3個樣本)及1月齡對應的12個樣本。利用illumina平臺進行的miRNA-Seq及mRNA-Seq檢測。之后進行轉錄組組裝、表達差異分析、序列特征分析、mRNA與miRNA結合位點分析、miRNA/基因負相關對的鑒定及免疫組化驗證實驗。

 

 

實驗結果

 

實驗取樣情況根據(jù)圖1所示。樣本經過RNA-seq和miRNA-Seq之后，使用有參和從頭組裝方法進行轉錄組分析。檢測到了15，024個具有顯著差異的基因，平均每個有1，502.4個，范圍從188個(A. sagittae vs. A. amarillo)到3，671個差異基因(A. astorquii vs. A. amarillo)(圖2a)。主成分分析表明有很強的系統(tǒng)遺傳信號(圖2b-c)。

圖1、尼加拉瓜的湖泊和五種慈鯛魚群體的代表性標本的照片

圖2、跨物種的慈鯛樣本基因表達模式。a)成對物種比較(用箭頭連接)中mRNAs差異表達 (圓圈上面數(shù)字)和差異表達miRNAs(圓圈下面數(shù)字)的數(shù)量。湖間比較中差異mRNA數(shù)量最高，這反映了它們的系統(tǒng)發(fā)育差異。b)樣本mRNA PCA散點圖。c) 樣本miRNA PCA散點圖。

 

對于每個物種，鑒定的成熟miRNAs的數(shù)量從178到289個不等，由241-369個miRNA基因編碼。miRNAs和miRNA基因數(shù)量之間觀察到差異的原因可以在miRNA生物發(fā)生中找到，因為相同的成熟miRNAs可以由不同的miRNA基因編碼。實驗發(fā)現(xiàn)這些慈鯛魚類共有147個成熟miRNAs，而3-21個相同的成熟miRNAs顯示出物種特異性表達(圖3)。

 

圖3、miRNA在一個物種中唯一表達和在五個物種中共有表達情況。五個物種的顏色代碼與圖2中使用的相同。點描繪了哪些物種共享miRNAs集。連接點的每一行上方的條顯示了存在的miRNAs的數(shù)量。在條線圖中，每個條的橙色部分表示數(shù)據(jù)集中與miRBase中已知miRNAs同源的表達miRNAs的數(shù)量。黑色代表miRBase中并不存在的miRNAs。

 

 

通過成對的物種比較，檢測到了從3對到58對強負相關的miRNA/基因，總共158對。由于在一個以上的物種對比較中檢測到了其中的23個，在整個數(shù)據(jù)集上識別的唯一負相關對的絕對數(shù)量是124。這158個強負相關對涉及87個獨特的基因和48個獨特的miRNAs。其中，64個基因被單個miRNA靶向，而其余23個基因被多個miRNA靶向。值得注意的是，這五種miRNAs在與它們負相關的靶基因上顯示了相同的假定效應信號。

 

表1、13個mRNA-miRNA強負相關對的注釋。

 

之后使用ISH驗證了部分基因/miRNA強負相關對。第一個基因/miRNA強負相關對包括眾所周知的miRNA let-7d(mir-69)及其預測的基因(igdcc3)。如圖4所示，igdcc3的表達從孵化日降低到1日齡，而let-7d的表達在發(fā)育過程中增加，這與負調節(jié)相互作用一致。特別是在大腦的最前部，igdcc3的下調和let-7d的上調之間有明顯的相關性。

圖4、miRNA let-7d及其靶基因igdcc3的ISH驗證。當魚胚胎第一次孵化時，miRNA let-7d在頭部和身體的整個背部區(qū)域顯示低表達(a)。然而，其靶基因igdcc3表達相對較高(b)。在1 dph時，let-7d在胚胎頭部的表達明顯增加(c)，而在同一發(fā)育階段，其靶基因的表達減少(d)。黑色箭頭表示該結構域是let-7d miRNA最顯著的調節(jié)作用。

 

 

本研究驗證的第二個強負相關對為一個新的miRNA (mir-250)及其靶標(cyp3A40)，其預測靶的表達在頭部區(qū)域顯示出彌漫的無處不在的表達模式，但是mir-250表達區(qū)域有明顯的下調。因此，mir-250和cyp3A40顯示了負相關。

圖5、miRNA mir-250及其靶基因cyp3A40的ISH。

 

 

 

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