【昊閱讀】利用SSR標(biāo)記分析古代銀杏群體的遺傳多樣性

發(fā)稿時(shí)間：2019-12-29來(lái)源：天昊生物

題目：Analysis of genetic diversity of ancient Ginkgo populations using SSR markers

發(fā)表期刊：Industrial Crops and Products  發(fā)表時(shí)間：2019-11-18  影響因子：4.191

 

銀杏（Ginkgo biloba L.）是一種著名的孑遺植物，也是銀杏綱唯一幸存的物種。為了探討銀杏地理種群的遺傳變異和冰川期可能避難所，研究者利用22個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)6個(gè)古種群和2個(gè)栽培種群的216份樣品進(jìn)行了分析。在22個(gè)SSR位點(diǎn)共檢測(cè)到231個(gè)等位基因，平均預(yù)期雜合度(He)為0.808，表明遺傳多樣性水平較高。STRUCTURE、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和主坐標(biāo)(PCoA)分析結(jié)果表明，8個(gè)種群可分為2個(gè)類(lèi)群，即東部類(lèi)群(TM、NJ和PZ)和西南部類(lèi)群(PX、DY、MJ、FG和WC)。東部組和西南部組分別有15個(gè)和14個(gè)獨(dú)特的等位基因。在這些群體中，來(lái)自東部的群體TM具有最高的遺傳多樣性和等位基因豐富度，在該群體中檢測(cè)到9個(gè)稀有等位基因和8個(gè)特異等位基因。雖然西南地區(qū)WC群體的遺傳多樣性低于TM群體，但在WC群體中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)稀有等位基因和2個(gè)特異等位基因。據(jù)推測(cè)，東部的群體TM地區(qū)和西南部的群體WC地區(qū)是冰川期的避難所。此外，在來(lái)自東部的2個(gè)栽培種群中總共檢測(cè)到7個(gè)特異等位基因，這表明在冰川期期間可能還有其他避難所。

1、研究背景

銀杏作為一種“活化石”，是銀杏屬中唯一的物種。銀杏不僅是一種非常重要的藥用植物，還具有木材和觀賞用途。此外，銀杏因其起源早、生命力強(qiáng)，對(duì)植物物種起源和進(jìn)化的科學(xué)研究非常有價(jià)值。然而，關(guān)于銀杏的起源，沒(méi)有確鑿的證據(jù)或公認(rèn)的結(jié)論。侏羅紀(jì)時(shí)期銀杏科物種幾乎遍布全球，然而，隨著白堊紀(jì)晚期地球氣候的劇烈變化，銀杏樹(shù)屬物種開(kāi)始減少。到第四紀(jì)冰川期開(kāi)始時(shí)，冰川運(yùn)動(dòng)已經(jīng)導(dǎo)致北美和歐洲所有銀杏滅絕。幸運(yùn)的是，由于特殊的地形特征，中國(guó)的一些地方由于冰川侵蝕，成為銀杏的獨(dú)特避難所。然而，這些庇護(hù)所的數(shù)量和地點(diǎn)尚未得到確認(rèn)。

在本研究中，研究者調(diào)查了分布在兩個(gè)潛在避難所的銀杏資源，并收集了古代種群。結(jié)合兩個(gè)人工林，利用SSR標(biāo)記(1)了解這兩個(gè)潛在保護(hù)區(qū)的遺傳多樣性和種群間的關(guān)系；(2)探索銀杏在中國(guó)的可能起源和可能保護(hù)區(qū)。

 

2、材料和方法

植物材料

在中國(guó)西南部發(fā)現(xiàn)了五個(gè)古代種群(PX，DY，MJ，F(xiàn)G和WC)，而在中國(guó)東部只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)古代種群(TM)。取樣樹(shù)之間的距離超過(guò)50 m，以降低取樣樹(shù)相關(guān)的概率(小種群除外)。為了比較古老種群和栽培種群之間的遺傳差異，從中國(guó)東部共選出兩個(gè)栽培種群(NJ和PZ)?？偣矎?個(gè)古代種群和2個(gè)種植園收集了216個(gè)個(gè)體。收集幼葉，用硅膠干燥，在-80℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)群體的詳細(xì)信息見(jiàn)表1和圖1。

表1、銀杏種群相關(guān)信息

 圖1、銀杏8個(gè)種群的地理分布。PX，DY，MJ，F(xiàn)G，WC和TM是古代種群，NJ和PZ是栽培種群。

DNA提取及SSR標(biāo)記基因分型

使用CTAB方法提取總基因組DNA。根據(jù)擴(kuò)增的多態(tài)性、穩(wěn)定性和清晰度，從本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的556個(gè)SSR標(biāo)記中選擇了22個(gè)SSR標(biāo)記，包括8個(gè)表達(dá)序列標(biāo)記(E-SSR)和14個(gè)基因組標(biāo)記(G-SSR) (表2)。使用ABI Veriti 96 PCR system (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)對(duì)所有標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用96個(gè)毛細(xì)管3730xl DNA分析儀分離反應(yīng)產(chǎn)物。

數(shù)據(jù)分析

對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，使用Peak Scanner軟件(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)分析基因型結(jié)果，具有相同堿基大小的條帶用相同的大寫(xiě)字母表示。使用POPGENE軟件測(cè)定觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合性(Ho)、預(yù)期雜合性(He)、Nei多樣性指數(shù)(H)、遺傳變異指數(shù)(Fst)、基因流(Nm)和Hardy-Weinberg平衡評(píng)估值(通過(guò)卡方檢驗(yàn)評(píng)估)。使用PowerMarker軟件進(jìn)行多態(tài)性信息含量(PIC)的測(cè)定和基于neighbor-joining方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。使用FSTAT軟件分析等位基因豐富度。分子方差分析(AMOVA)和主坐標(biāo)分析(PCoA)使用GenAlEx軟件進(jìn)行。

為了估計(jì)個(gè)體祖先，本文使用STRUCTURE軟件對(duì)八個(gè)樣本集(DY、MJ、FG、WC、PX、TM、NJ和PZ)進(jìn)行貝葉斯聚類(lèi)分析。對(duì)于每個(gè)K值(潛在祖先群體的數(shù)量，范圍從1到9(群體數(shù)量+ 1))，基于混合模型估計(jì)每個(gè)個(gè)體的遺傳祖先；估計(jì)是用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)方法獲得的，進(jìn)行迭代100，000次及100，000次的burn-in。根據(jù)STRUCTURE HARVESTER中的Evanno方法確定了最佳K值。結(jié)果用CLUMPP和DISTRUCT繪制。

3、研究結(jié)果

遺傳多樣性

基于來(lái)自六個(gè)古老群體和兩個(gè)栽培群體的216個(gè)樣本，在22個(gè)SSR基因座共獲得231個(gè)等位基因(圖2)。每個(gè)SSR基因座的等位基因數(shù)從5到20不等，平均每個(gè)基因座有10.5個(gè)等位基因(表3)。總的來(lái)說(shuō)，平均Ne、He和PIC分別為6.104、0.808和0.781，表明216個(gè)樣品含有高水平的遺傳多樣性。在22個(gè)SSR基因座中，E-SSR32基因座遺傳多樣性水平最低，Ne最小(2.386)，He最低(0.582)，PIC最低(0.565)。相比之下，G-SSR38基因座表現(xiàn)出最高的多樣性，因?yàn)樵摶蜃哂凶畲蟮腘e (12.130)、He (0.920)和PIC (0.912)。然而，22個(gè)SSR位點(diǎn)的等位基因頻率明顯偏離哈迪-溫伯格平衡(P < 0.05)。

圖2、E-SSR32基因座位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物分離圖譜。前四個(gè) (從A到D)來(lái)自WC種群，后四個(gè)(從E到H)來(lái)自TM種群。

總的來(lái)說(shuō)，六個(gè)古代和兩個(gè)栽培群體的遺傳多樣性沒(méi)有顯示出很大不同，這些群體的遺傳多樣性從高到低依次為T(mén)M、WC、PX、NJ、PZ、MJ、FG和DY。在八個(gè)群體中，He值高于Ho值，表明雜合子缺乏(表4)。在6個(gè)種群中，種群TM表現(xiàn)出最高的遺傳多樣性，群體DY的遺傳多樣性最低。西南地區(qū)古樹(shù)的遺傳多樣性(WC、PX、FG、DY和MJ)也是略不同于東部古樹(shù)的遺傳多樣性(TM)。

表4、8個(gè)群體22個(gè)SSR位點(diǎn)遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)平均值。

遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)

八個(gè)銀杏群體的遺傳變異系數(shù)Fst為0.093，表明群體間的遺傳變異很小，這可能是由于群體間的平均基因流較高(Nm=2.427，表3)。AMOVA的結(jié)果揭示了區(qū)域間(西南和東部)、區(qū)域內(nèi)和群體內(nèi)群體間的顯著遺傳差異(表5)，但變異集中在群體內(nèi)?？偟膩?lái)說(shuō)，3%的變異發(fā)生在地理區(qū)域之間，10%和87%的變異分別發(fā)生在區(qū)域內(nèi)和群體內(nèi)的群體之間。

表3、22個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性信息。

表5、來(lái)自8個(gè)種群的216個(gè)個(gè)體的AMOVA分析。

 

為了分析銀杏群體的遺傳結(jié)構(gòu)，基于貝葉斯聚類(lèi)模型分析了群體間的親緣關(guān)系。根據(jù)DK的結(jié)果，當(dāng)DK處于最大值時(shí)，最佳的K值是2(圖3)。

圖3、聚類(lèi)數(shù)(K)與相應(yīng)的DK之間的關(guān)系圖。

當(dāng)K為2時(shí)，來(lái)自六個(gè)古代群體和兩個(gè)栽培群體的216個(gè)樣本的遺傳信息來(lái)自?xún)蓚€(gè)差異祖先群體(圖4a)。在K= 2時(shí)，中國(guó)西南部五個(gè)古代群體(PX、DY、MJ、FG和WC)的大部分遺傳信息來(lái)自同一個(gè)祖先群體(綠色)，而中國(guó)東部的TM和兩個(gè)栽培群體(NJ和PZ)的遺傳信息主要來(lái)自另一個(gè)祖先群體(紅色)。在K = 3和4時(shí)，來(lái)自東方的三個(gè)群體的大多數(shù)遺傳信息仍然來(lái)自相同的祖先群體，這表明

兩個(gè)栽培種群(NJ和PZ)的起源與種群TM密切相關(guān)。然而，在西南部的五個(gè)古代群體中發(fā)現(xiàn)了基因差異。在五個(gè)古老的種群中，WC和PX種群具有豐富的遺傳變異和起源的遺傳信息。DY和MJ群體中的大多數(shù)遺傳信息來(lái)源相似，與WC和PX群體也密切相關(guān)。另外，群體FG中的遺傳信息是WC和PX群體中遺傳信息的混合，表明群體FG的形成受兩個(gè)古老群體的影響。

結(jié)果表明，8個(gè)種群的216個(gè)樣本可分為2個(gè)類(lèi)群(I組和II組)，這與種群結(jié)構(gòu)分析的模式一致。東部的TM、NJ和PZ三個(gè)種群的大部分遺傳信息屬于第一組，而西北部的五個(gè)古種群的大部分遺傳信息屬于第二組。此外，PCoA的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖4-C)?？傊鶕?jù)遺傳數(shù)據(jù)，這六個(gè)古代和兩個(gè)栽培種群的起源明顯不同，這些種群被分為西南組(PX、WC、DY、MJ和FG)和東部組(TM、NJ和PZ)。

圖4、A)基于貝葉斯聚類(lèi)模型的216個(gè)樣本群體遺傳結(jié)構(gòu)，K = 2-4。B)基于Nei’s遺傳距離的鄰居連接樹(shù)。C) PCoA圖。結(jié)果表明，樣品可分為兩類(lèi)。

稀有等位基因和特異等位基因

在種群擴(kuò)張過(guò)程中，低頻等位基因比高頻等位基因更容易丟失，這使得低頻等位基因成為種群起源研究的重要基礎(chǔ)。一般來(lái)說(shuō)，原始群體比正常群體含有更多稀有等位基因和(或)特異等位基因。在216個(gè)樣本中檢測(cè)到的231個(gè)等位基因的頻率范圍從0.0023到0.6319，平均為0.0952。22個(gè)SSR基因座的最小等位基因頻率在0.0023-0.0370之間，平均為0.0144。為了研究群體間的遺傳變異，分析了在兩個(gè)群體中檢測(cè)到的稀有等位基因和僅在一個(gè)群體中檢測(cè)到的特異等位基因(圖5)。在22個(gè)SSR位點(diǎn)檢測(cè)到18個(gè)稀有等位基因和17個(gè)特異等位基因。8個(gè)SSR位點(diǎn)具有稀有等位基因，其中279、183和354比其他位點(diǎn)含有更多的稀有等位基因。10個(gè)SSR位點(diǎn)中分布有特異的等位基因，在32個(gè)位點(diǎn)和8個(gè)位點(diǎn)分別檢測(cè)到4個(gè)和3個(gè)等位基因。除DY群體外，其他群體都含有稀有等位基因，WC (8)和TM (9)群體比其他群體(3–4)含有更多稀有等位基因。四個(gè)群體(WC、TM、PZ和NJ)具有獨(dú)特的等位基因，而群體TM具有最獨(dú)特的等位基因(8)，其次是新澤西州(6)、華盛頓(2)和PZ (1)。值得注意的是，盡管西南方的WC種群幾乎沒(méi)有特異的等位基因，但西南方的五個(gè)種群有14個(gè)等位基因在東部種群中未檢測(cè)到(表6)，這表明西南方的古種群包含特異的遺傳信息。

圖5、8個(gè)銀杏群體中稀有和獨(dú)特等位基因的數(shù)量。

表6、西南5個(gè)群體中14個(gè)等位基因的頻率。

 

4、討論及結(jié)論

遺傳多樣性作為衡量一個(gè)物種適應(yīng)環(huán)境變化能力的重要指標(biāo)，受到許多因素的影響，如選擇、遺傳漂變、遷移和繁殖系統(tǒng)。研究銀杏種群的遺傳多樣性，為銀杏資源的保護(hù)和利用提供理論參考。

中國(guó)西南部位于青藏高原東南部和云貴高原，高原形成天然屏障，有效的減緩了冰期西伯利亞寒流對(duì)該地區(qū)的影響。由于其穩(wěn)定的環(huán)境和多樣的地貌，該地區(qū)擁有中國(guó)最豐富的生物多樣性。本研究樣本來(lái)自中國(guó)兩個(gè)公認(rèn)的潛在避難區(qū)，具有遺傳多樣性，等位基因罕見(jiàn)且獨(dú)特。因此，這些樹(shù)木是重要的遺傳資源，可用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的樹(shù)木育種過(guò)程。然而，除FG和TM種群外，各種群的雌雄樹(shù)比例均呈現(xiàn)不同程度的不平衡，雌樹(shù)數(shù)量是雄樹(shù)數(shù)量的2-6倍。DY、FG和MJ種群中的古樹(shù)不到20棵，這些種群中的古樹(shù)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他古種群。此外，22個(gè)SSR位點(diǎn)的所有等位基因均明顯偏離哈迪-溫伯格平衡，所有古代群體均表現(xiàn)出純合子過(guò)量。因此，西南和東部的古銀杏種群受到人類(lèi)活動(dòng)和自然因素的影響，應(yīng)更加重視這兩個(gè)地方的古銀杏保護(hù)。

這項(xiàng)研究的結(jié)果證實(shí)，分布在兩個(gè)潛在避難所(西南和東部)的古銀杏種群具有高度的遺傳多樣性。兩地樣品間也發(fā)現(xiàn)了遺傳變異，西南地區(qū)的種群起源明顯不同，而東部種群起源明顯。在冰河時(shí)期，東部的種群總數(shù)和西南部的種群總數(shù)是兩個(gè)獨(dú)立的避難所，中國(guó)可能還有其他避難所。此外，古代種群受到人類(lèi)活動(dòng)和自然因素的影響，應(yīng)該進(jìn)一步保護(hù)。該研究不僅為銀杏避難所的研究提供了分子證據(jù)，也為古樹(shù)的開(kāi)發(fā)利用提供了理論指導(dǎo)。

 

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