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10x Genomics單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在植物幼苗細胞研究中的最新進展

發(fā)稿時間：2020-03-24來源：天昊生物

自2019年2月首篇利用10x Genomics的植物根尖單細胞圖譜“Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells”發(fā)表在Plant Physiology以來，陸續(xù)有相關(guān)研究見刊Developmental Cell 和Plant Cell。國內(nèi)第一篇植物10x單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）文章也于同年4月由植生所王佳偉研究組發(fā)表在 Molecular Plant上，題為"A single-cell RNA sequencing profiles the developmental landscape of arabidopsis root"。進入2020年以來，10x Genomics單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在植物上的應(yīng)用有了新的發(fā)展，已經(jīng)從根尖細胞發(fā)育拓展到對植物幼苗地上部分組織細胞的研究上，相關(guān)研究在線預(yù)發(fā)表在1月和2月bioRxiv上。今天我們就來簡單看下這兩篇文章。

1、題目：Single-cell transcriptome analyses recapitulate the cellular and developmental responses to abiotic stresses in rice

利用單細胞轉(zhuǎn)錄組分析水稻細胞和發(fā)育對非生物脅迫的響應(yīng)

發(fā)表期刊：bioRxiv 發(fā)表時間：2020-1-31

https://doi.org/10.1101/2020.01.30.926329

研究簡介

植物的新陳代謝和繁殖取決于細胞之間的分工。然而，具有各種功能的細胞通常作為一個整體進行研究，其特異性易被稀釋掉。本研究將單細胞RNA測序應(yīng)用于在各種環(huán)境中生長的水稻幼苗的地上部分。實驗通過捕獲成千上萬個細胞的轉(zhuǎn)錄組，識別所有主要的細胞類型，并重建它們的發(fā)育軌跡。研究者發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫不僅影響細胞類型的特異性基因表達，還影響細胞的物理大小和細胞群體的組成。實驗用顯微鏡驗證了其中一些結(jié)論，并用生信分析方法揭示相關(guān)發(fā)生機制?？偟膩碚f，本研究展示了水稻幼苗單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)，為推動植物生物學(xué)發(fā)現(xiàn)提供有利資源支撐。

材料與方法

植物材料和生長條件

水稻幼苗在Kimura B溶液中生長14天。對于高鹽度處理，幼苗在Kimura B溶液中生長11天，然后轉(zhuǎn)移到高鹽度溶液(Kimura B溶液加200mM NaCl)中再生長3天。對于低氮處理，幼苗在Kimura B溶液中生長9天，然后轉(zhuǎn)移到低氮溶液(木村B溶液僅含20 mM NH₄⁺)中再生長5天。兩周大的幼苗的地上部分被收獲用于scRNA-seq分析。

原生質(zhì)體的分離

從兩周大幼苗中分離水稻原生質(zhì)體。幼苗的莖和鞘部分被切成0.5-1毫米的條狀，用新磨尖的刀片。將條帶立即轉(zhuǎn)移到新鮮制備的酶溶液中，包括1.5% (w/v) cellulase R10、0.4% (w/v) macerozyme R10、0.6 M甘露醇、20 mM KCl、20 mM MES (pH = 5.5)和0.1% BSA。植物材料(0.5 g)在室溫下于黑暗中于5 ml酶溶液中孵育。在3 h輕微搖動后，消化混合物依次通過70 mm和40 mm尼龍篩網(wǎng)過濾。在洗滌兩次后收集原生質(zhì)體(300 g離心3分鐘)，并重新懸浮在8%甘露醇溶液中。用臺盼藍染色原生質(zhì)體，用細胞計數(shù)器測定細胞活力和數(shù)量。

scRNA-seq

根據(jù)10x Genomics官方方案及試劑盒，用新鮮原生質(zhì)體構(gòu)建scRNA-seq文庫，并用Illumina HiSeq雙端150 nt模式進行測序。對測序數(shù)據(jù)使用STAR、Cell Ranger進行單個細胞基因表達水平的估計和差異基因的鑒定。使用R包進行UMAP降維及細胞聚類分析。此外還利用前人研究的細胞特異性基因來鑒定細胞類群，對非生物脅迫下細胞特異性應(yīng)激反應(yīng)基因進行鑒定及發(fā)育軌跡等分析。

實驗結(jié)果

水稻幼苗地上部分主要細胞類型的鑒定

利用scRNA-seq獲得了總共4580個細胞的轉(zhuǎn)錄組，測得的UMIs和基因數(shù)量中位數(shù)分別為10256和2480個。通過UMAP分析及利用相互最近鄰法 (MNN)來校正批次效應(yīng)，最終將細胞分為五大類群 (圖1B)。根據(jù)已知功能基因的簇特異性表達將細胞分為五種類型—葉肉細胞、薄壁細胞、表皮細胞、泡狀細胞和原基細胞(圖1C)。

圖1、水稻幼苗單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。(A)單細胞轉(zhuǎn)錄組工作流程示意圖。(B)UMAP降維和五大細胞類群分類結(jié)果。(C)簇特異性基因的表達模式圖。

非生物脅迫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組變化因細胞類型而異

從未處理對照和低氮及高鹽處理的幼苗樣本中鑒定出所有五種細胞類型(圖2A)。之后在低氮或高鹽處理后，為每種細胞類型分析了差異表達基因（DEGs）及GO富集分析（圖2B-2D）。在所有五種細胞類型中，高鹽度和低氮處理的樣品之間的轉(zhuǎn)錄差異存在著顯著重疊，這意味著植物可能通過調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的共同基因轉(zhuǎn)錄對各種非生物脅迫做出響應(yīng)（圖2E）。

圖2、細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組對非生物脅迫的響應(yīng)。(A)在UMAP圖中三種不同處理的樣品在很大程度上相互重疊。(B)在低氮處理下，散點圖顯示葉肉細胞和薄壁細胞中的基因表達不同(紅色)。(C)對低氮脅迫有響應(yīng)的特異和共有細胞差異基因統(tǒng)計。左邊的條形圖顯示了每種細胞類型的差異基因數(shù)(包括上調(diào)和下調(diào))。上下條形圖分別顯示基因上調(diào)和下調(diào)數(shù)量。(D)低氮脅迫下每種細胞類型差異基因GO富集分析圖。(E)利用基因子集的UMAP分析。

mRNA的減少揭示了在應(yīng)激反應(yīng)期間表皮細胞變得更小

一個細胞中的總UMI值，反映了在scRNA-seq實驗中捕獲的整體mRNA群體，在某些細胞類型中其因脅迫而顯著不同(圖3A)。特別是，在低氮和高鹽處理下，表皮細胞中的總UMI顯著降低。據(jù)報告，一個細胞中的總與其在人體中的身體大小呈正相關(guān)；或者，總UMI可以簡單地反映細胞中RNA聚合酶的活性。為了驗證這些可能性，實驗從顯微圖像中估計細胞大小。在兩種壓力下，表皮細胞的面積都減少了，特別是在高鹽度下(圖3B-C)，表明每個細胞的總UMI數(shù)可以用來推斷表皮細胞的大小。為了理解脅迫應(yīng)激導(dǎo)致表皮細胞尺寸減小的潛在機制，研究者重建了從原基到表皮細胞的發(fā)育軌跡(圖3D-E)。雖然在所有三種情況下，總UMI數(shù)都隨著發(fā)育而增加，但比率是不同的(圖3F)。在低氮條件下生長的植物在原基-表皮細胞轉(zhuǎn)變過程中表現(xiàn)出細胞擴張的延遲。除此之外，在高鹽度條件下生長的植物顯示出原基和表皮細胞的整體大小減小，這可能與滲透壓增加導(dǎo)致細胞壁上的膨壓降低有關(guān)?？偟膩碚f，這些結(jié)果揭示了非生物脅迫導(dǎo)致細胞類型特異性大小變化。

圖3、細胞大小對非生物脅迫的響應(yīng)。(A)在高鹽度和低氮脅迫下，某些細胞類型中的總UMI值顯著降低。(B-C)對照和脅迫處理樣品中表皮細胞的細胞大小統(tǒng)計。(D-E)從原基到表皮細胞的發(fā)育軌跡。(F)細胞大小(從細胞的總UMI推斷)隨著擬時軌跡的變化而增加。

非生物脅迫減緩向葉肉細胞的分化

非生物脅迫處理也改變了細胞群體的組成(圖4A)。特別是葉肉細胞的比例減少，薄壁細胞的比例增加，以應(yīng)對高鹽或低氮脅迫。在顯微鏡下，觀察到紅色自發(fā)熒光的強度降低了約50%，這是由主要存在于葉肉細胞中的葉綠體發(fā)出的(圖4B–C)。為了理解潛在的發(fā)育機制，實驗重建了從原基到葉肉和薄壁細胞的發(fā)育軌跡。研究者觀察到從原基到葉肉細胞的主要發(fā)育軌跡，薄壁細胞作為中間體(圖4D–E)，這與葉肉細胞主要由折疊的薄壁細胞組成相呼應(yīng)。為了研究非生物脅迫對細胞增殖和分化的影響，從66個組蛋白編碼基因的平均表達水平推斷了細胞增殖速率，這些基因在DNA合成階段特異性表達。在所有三種情況下，發(fā)育軌跡上的增殖速率顯著降低(圖4F)。值得注意的是，在高鹽度或低氮處理的薄壁組織-葉肉轉(zhuǎn)變過程中，細胞增殖受到顯著抑制(圖4F)。為了進一步剖析脅迫下減緩葉肉細胞分化的調(diào)控機制，研究者在發(fā)育軌跡中鑒定了1496個高度可變的基因。這些基因分為四個不同的基因類別，并在整個發(fā)育過程中以有序的時間順序描述基因表達的波動(圖4G-H)。在擬時時間軸中間表達的基因與薄壁細胞向葉肉細胞的轉(zhuǎn)變有關(guān)。這較好解釋了薄壁細胞在脂質(zhì)儲存和代謝中起作用，而脂質(zhì)儲存和代謝通常與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，葉肉細胞的延遲發(fā)育不僅有利于水稻幼苗減少光合作用的能量消耗，而且促進了對惡劣環(huán)境的抗性。

圖4、細胞群體對非生物脅迫的組成響應(yīng)。(A)高鹽度或低氮脅迫下細胞類型比例的變化。該比例通過將一種類型的細胞數(shù)除以樣品中捕獲的細胞總數(shù)來計算。(B-C)在三種條件下生長的水稻幼苗水平切片的顯微圖像及統(tǒng)計。(D-E)原基向薄壁細胞和葉肉細胞分化的發(fā)育軌跡。每個點代表一個細胞，并由偽時間(D)或細胞類型(E)著色。(F)增殖速率隨著發(fā)育擬時軌跡變化而降低，特別是在非生物脅迫下。(G-H) 在發(fā)育軌跡中的基因動態(tài)表達圖及統(tǒng)計。

實驗結(jié)論

在這項研究中，研究者首次嘗試將scRNA-seq應(yīng)用于水稻樣品的地上部分，沒有進行相同處理的重復(fù)，因為數(shù)百個單獨的細胞可以作為重復(fù)。進行了兩種脅迫處理(低氮和高鹽)，觀察到部分共有的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)情況?？俇MI值的變化本研究中被用來推斷細胞大小。原生質(zhì)體的效率可能因處理不同而不同。用顯微數(shù)據(jù)驗證了脅迫處理后葉肉細胞數(shù)量的變化。

2、題目：Global dynamic molecular profiles of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing

用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序研究氣孔細胞發(fā)育的全局動態(tài)分子特征圖譜

發(fā)表期刊：bioRxiv 發(fā)表時間：2020-2-14

https://doi.org/10.1101/2020.02.13.947549

研究簡介

氣孔譜系細胞發(fā)育的調(diào)控雖然已有廣泛研究，但是基于單細胞轉(zhuǎn)錄組分析這一生物過程的綜合特征尚未有報道。在這里，研究者對來自5日齡擬南芥幼苗子葉的超過12844個細胞進行了scRNA-seq分析。利用一系列新的標記基因鑒定了11個細胞類群，主要對應(yīng)于特定氣孔發(fā)育階段的細胞。對這些細胞類群中具有最高可變表達基因的比較分析揭示了調(diào)節(jié)葉肉和保衛(wèi)細胞的發(fā)育，以及從原皮到保衛(wèi)母細胞的分化的三個轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。研究者通過擬時軌跡分析研究了標記基因的動態(tài)發(fā)育過程，揭示了它們之間潛在的相互作用。幾個新標記基因的鑒定提示氣孔譜系細胞發(fā)育過程中新的調(diào)控機制。

材料及方法

子葉收集和原生質(zhì)體制備

實驗從5日齡的擬南芥幼苗子葉中分離出原生質(zhì)體，通過浸沒在溶液(0.5 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, 5 mM MES, 1.5% Cellulase RS, 0.03% Pectolyase Y23, 0.25% BSA, actinomycin D [33 mg/L]和cordycepin [100mg/L], pH 5.5)中的幼苗收獲子葉。然后將樣品孵育4 h以分離原生質(zhì)體。然后，用8%甘露醇緩沖液洗滌分離的細胞三次，以除去Mg²⁺。然后用40um的細胞過濾器過濾細胞。用臺盼藍染色檢測細胞活性，用細胞計數(shù)器測量細胞濃度。

scRNA-seq文庫制備及分析

scRNA-seq文庫制備根據(jù)試劑盒提供的用戶手冊進行。利用Cell Ranger進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，在Seurat中對過濾后的矩陣進行庫大小歸一化，獲得歸一化的計數(shù)。采用主成分分析法對最易變基因進行降維。通過基于圖形的方法對細胞進行聚類，并使用tSNE進行二維可視化。利用Monocle 2進行擬時軌跡分析。具有最高可變表達的基因被用于聚集細胞。然后將基因表達繪制為擬時函數(shù)，以跟蹤擬時的變化，并沿著推斷的擬時發(fā)育軌跡繪制了TF和標記基因。根據(jù)PlantTFDB數(shù)據(jù)庫，用Cytoscape繪制了轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用Metascape進行DEGs的GO富集分析。

顯微鏡觀察實驗

利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察萌發(fā)后5 d的子葉及綠色熒光蛋白熒光圖像。

實驗結(jié)果

氣孔譜系細胞基因表達模式及細胞類型鑒定

本研究從使用t-SNE將細胞分成11個類群，之后選擇有代表性的標記基因來鑒定每種不同的細胞類型(圖1)。

圖1、利用代表性標記基因的細胞類型鑒定。(A)標記基因在不同細胞類型中的表達示意圖。(B)氣孔發(fā)育過程中標記基因表達的動態(tài)模式分析。(C)根據(jù)每個細胞類群中標記物的表達模式鑒定細胞類型。

圖2、每個聚類新標記基因的鑒定。(A)每個聚類中代表性標記基因表達的熱圖。(B)每種細胞類型中代表性標記基因表達小提琴圖。

ATML1參與調(diào)節(jié)氣孔譜系細胞的發(fā)育

為了探索分生母細胞（MMC）的潛在調(diào)節(jié)因子，實驗分析了MMC中的標記基因，發(fā)現(xiàn)ATML1、PDF1、MUTE和SPCH具有高度相似的表達譜(圖2A)。為了研究ATML1對氣孔譜系細胞生物發(fā)生的影響，研究者使用ATML1突變體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，atml1-2和atml1-3植物在氣孔譜系細胞的發(fā)育方面存在缺陷(圖3A-F)。進一步的RT-PCR反應(yīng)分析表明，SPCH和MUTE在atml1-2和atml1-3中的表達水平低于野生型(圖3G)，表明atml1可以通過調(diào)節(jié)SPCH和MUTE的表達來調(diào)節(jié)氣孔譜系細胞的發(fā)育。

圖3、ATML1參與調(diào)節(jié)氣孔的發(fā)育。(A-D)以atml1-2(Ler背景)、atml1-3(Col背景)

不同細胞類型富集基因的GO分析

為了研究在每種細胞類型中表達的基因的潛在生物學(xué)功能，研究者對所有細胞群進行了GO分析(圖4)。結(jié)果顯示，在不同細胞類型中鑒定的富集基因的數(shù)量及GO存在顯著差異。

圖4、不同細胞類型中表達基因的GO分析。(A)不同聚類中可變表達最高的基因的GO熱圖分析。(B) MMC、GMC、EM和LM細胞類群中基因GO熱圖分析。

不同細胞類型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析及鑒定

為了研究不同細胞類型發(fā)育的調(diào)節(jié)機制，研究者分析了每一種細胞類型中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，確定了最高數(shù)量的轉(zhuǎn)移因子類型及在不同細胞中的異同（圖5）。并且通過實驗確定WRKY33、BPC蛋白參與了氣孔細胞譜系發(fā)育（圖6、圖7）。

圖5、不同細胞類型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的鑒定。(A)不同細胞類型轉(zhuǎn)錄因子的鑒定。(B) MPC和PC細胞中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。(C) PC和GC細胞中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。(D) MMC、EM、LM和GMC細胞中轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。(E) PDC和 GMC中轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析。

圖6、核心轉(zhuǎn)錄因子的特征圖和功能分析。(A)不同聚類中代表性轉(zhuǎn)錄因子表達的特征圖。(B)野生型對照WT和wrky33幼苗子葉氣孔譜系細胞的發(fā)育模式。(C)根據(jù)(B)計算的細胞類型頻率。

圖7、BPC蛋白參與調(diào)節(jié)氣孔的發(fā)育。(A)對BPC6-GFP亞細胞定位的分析。(B)SCRM和SCRM2在bpc六突變體中表達的qPCR分析。(C)5日齡bpc突變體和轉(zhuǎn)基因植株子葉中氣孔譜系細胞的發(fā)育模式。(D)根據(jù)(C)計算的細胞類型頻率。(E)生長在MS培養(yǎng)基上的突變體的表皮細胞數(shù)。

標記基因表達的擬時發(fā)育軌跡分析

為了重建分化過程中的發(fā)育軌跡，研究者使用Monocle 2軟件對scRNA-seq數(shù)據(jù)進行了擬時排序?？偟膩碚f，擬時路徑有三個分支(圖8A、B)。為了研究每個聚類中基因的擬時模式，實驗對所有高表達基因進行了熱圖分析，所有基因的擬時模式可以分為三類(圖8C)。之后在每個聚類中選擇前5個標記基因來分析它們的擬時模式(圖8D)。從熱圖和擬時曲線可以看出，SPCH、MUTE和FAMA的表達主要發(fā)生在PDC和MMC、MMC和M、GMC和GC細胞類型之間(圖9)。

圖8、類群和所選標記基因的擬時分析。(A)每個類群細胞在擬時軌跡上的分布。(B)根據(jù)類群標記著色的擬時軌跡。(C) 擬時進程中所有基因的聚集。(D)代表基因沿氣孔譜系細胞擬時進程的聚集和表達動態(tài)分析。

圖9、已知標記基因的擬時分析。(A)沿著氣孔譜系細胞的擬時進程聚集代表性基因。(B)沿著代表性基因的擬時進程的基因表達動態(tài)分析。

實驗結(jié)論

本研究利用scRNA-seq探討了可追溯的、不可逆的氣孔譜系細胞的命運決定過程，鑒定出不同分化細胞類型，并在不同的細胞類型中發(fā)現(xiàn)了一系列新的標記基因。實驗還通過檢查相應(yīng)突變體子葉中的氣孔發(fā)育模式，分析了一些標記基因?qū)饪鬃V系細胞發(fā)育的影響，并且分析了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在調(diào)節(jié)氣孔譜系細胞發(fā)育中的作用，探討了氣孔譜系細胞的發(fā)育擬時軌跡及其調(diào)控機制。

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