喜訊！天昊微生物項目文章登陸國際精神疾病領域頂級期刊《Molecular Psychiatry》

發(fā)稿時間：2020-04-27來源：天昊生物

西安交通大學第一附屬醫(yī)院近期在國際精神疾病領域頂級期刊《分子精神學》（Molecular Psychiatry）上發(fā)表了移植未經藥物治療的精神分裂癥患者腸道微生物會導致受體小鼠出現精神分裂癥相關異常行為和犬尿氨酸代謝失調的研究文章，在這項研究中天昊生物有幸承擔了微生物測序相關工作。在恭喜客戶發(fā)表高分文章的同時，我們想跟大家分享一下這篇文章的研究思路。英文題目：Transplantation of microbiota from drug-free patients with schizophrenia causes schizophrenia-like abnormal behaviors and dysregulated kynurenine metabolism in mice中文題目：移植未經藥物治療的精神分裂癥患者腸道微生物會導致受體小鼠出現精神分裂癥相關異常行為和犬尿氨酸代謝失調期刊名：Molecular Psychiatry影響因子：11.973發(fā)表單位：西安交通大學第一附屬醫(yī)院
  

研究概要

越來越多的證據表明，腸道菌群通過菌群-腸-腦軸在精神分裂癥的發(fā)病機制中起作用。這項研究試圖調查將未經藥物治療的精神分裂癥患者的腸道菌群移植到SPF小鼠是否會導致小鼠出現精神分裂癥相關異常行為，結果表明，將精神分裂癥患者的糞便菌群移植到SPF小鼠中會引起其行為異常，例如精神運動過度活躍，學習和記憶受損，這些小鼠還顯示，與接受健康對照組糞便的受體小鼠相比，接受精神分裂癥患者糞便的小鼠的外周組織和大腦中色氨酸降解的犬尿氨酸-犬尿酸通路富集，前額葉皮質的基礎細胞外多巴胺和海馬區(qū)的5-羥色胺增加。此外，移植患者糞便微生物群的小鼠的結腸腔內濾液使培養(yǎng)肝細胞和前腦皮質切片中的尿酸合成和犬尿氨酸轉氨酶II活性上調。60種供體來源的細菌在移植患者和對照組糞便微生物群的小鼠之間顯示出顯著差異，突出了78種不同富集的功能模塊，包括色氨酸生物合成功能?？傊覀兊难芯勘砻?，腸道微生物群組成的異常部分通過色氨酸-犬尿氨酸代謝的調控參與了精神分裂癥的發(fā)病。

 

研究背景

精神分裂癥是一種慢性嚴重精神障礙，估計終生患病率為1％，是導致殘疾的全球主要原因之一。盡管精神分裂癥給公共衛(wèi)生帶來沉重負擔，但潛在的發(fā)病機理的機制尚未完全了解。數十年的研究表明，遺傳因素和環(huán)境因素均與精神分裂癥的發(fā)展相關。腸道微生物組是由遺傳和環(huán)境因素共同調節(jié)的腸-腦軸的關鍵組成部分，它很可能在宿主生理學和疾病病理生理學方面協(xié)同遺傳和環(huán)境效應。這些腸道微生物也被視為影響神經內分泌功能和大腦發(fā)育的重要因素。有趣的是，精神分裂癥的幾種環(huán)境危險因素，包括剖宮產，早期生活壓力，饑荒期間母親營養(yǎng)不良以及孕產婦的免疫激活，都對腸道微生物組產生了深遠的影響。 因此，對腸道微生物組的作用進行評估對于全面了解精神分裂癥的發(fā)病機理和發(fā)展是必要的。微生物研究技術的最新進展，例如糞菌移植（FMT）和微生物組關聯研究（MWAS），是揭示腸道菌群在肥胖，糖尿病，神經系統(tǒng)和神經發(fā)育疾病中作用的重要工具。在過去的十年中，腸道菌群在精神障礙的病理生理中的潛在作用引起了人們的廣泛關注。盡管據報道一些微生物分類群與精神分裂癥和狂躁癥有關，但這些微生物豐度變化的功能性潛在后果仍不清楚。最近，使用MWAS策略我們觀察到與健康對照組相比，精神分裂癥患者的腸道微生物組受到干擾（未發(fā)表的數據），然而，需要進一步的研究以揭示腸道微生物的組成變化僅僅是生理和生活方式失調的結果，還是在精神分裂癥的病理生理中發(fā)揮功能性作用。最近的一項研究報告說，來自精神分裂癥患者的腸道微生物組在無菌（GF）的受體小鼠中誘導了精神分裂癥相關的行為，表明腸道微生物群失調對精神分裂癥病理心理學有貢獻。移植的外來微生物群相對容易棲息在無菌（GF）小鼠的腸道內，因為幾乎沒有來自固有微生物的干擾。此外，已知無菌（GF）小鼠表現出腸道和大腦發(fā)育失調，并表現出異常行為，例如神經傳遞失調，運動過度和焦慮樣行為減少。先前的報道表明，具有這種缺陷的小鼠由于其固有的病理生理學特性，可能不是研究微生物群對神經化學，神經傳遞和行為影響的理想模型。因此，本研究選擇檢查人類微生物群對具有正常大腦發(fā)育和功能的無特定病原體（SPF）小鼠的影響。由于免疫/炎癥，代謝和神經內分泌系統(tǒng)的系統(tǒng)性損傷是精神分裂癥的標志性癥狀，并且此類系統(tǒng)與腸道菌群有關，因此可以想象這些微生物在精神分裂癥中起作用。腸道微生物群可以調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸，控制腎上腺皮質激素和皮質酮的釋放，而皮質酮在精神分裂癥患者中常常是異常的。炎癥假說表明，患者體內細胞因子和炎癥介質的紊亂以及精神分裂癥的臨床前模型會驅動疾病癥狀的發(fā)展。細菌分解色氨酸代謝產生的代謝產物可在腸道局部和中樞神經系統(tǒng)遠端調節(jié)炎癥和疾病發(fā)展。此外，腸道中的細菌將食物來源的色氨酸分解為一系列神經活性代謝產物，例如犬尿氨酸（Kyn），犬尿酸（Kyna），喹啉酸（Quia）。這些小的分解代謝產物能夠遠程影響中央谷氨酸和5-羥色胺系統(tǒng)。此外，腸道菌群還調節(jié)大腦中去甲腎上腺素，多巴胺和5-羥色胺的代謝。結腸腸嗜鉻細胞中5-羥色胺的生物合成受原生孢子形成細菌的控制，γ-氨基丁酸（GABA）由谷氨酸經一系列乳酸桿菌和雙歧桿菌物種代謝。因此，這些神經遞質可能是腸道菌群與導致精神分裂癥的腦病理生理學之間的潛在介體。 由于這些途徑和分子在精神分裂癥的發(fā)病機理和進程中具有至關重要的作用，因此有必要研究哪些調節(jié)它們的微生物可能參與精神分裂癥的心理病理過程。在這項研究中，我們將精神分裂癥患者的腸道菌群移植到SPF小鼠，我們的結果提供了進一步的證據，即腸道微生物組的改變會促進精神分裂癥相關癥狀，如精神運動亢進和學習記憶力減退。我們對HPA軸，促炎性細胞因子，色氨酸代謝途徑和神經遞質系統(tǒng)的分析表明，色氨酸代謝失調，尤其是激活的Kyn途徑很可能是微生物引起的小鼠精神分裂癥樣行為異常的原因。

 

主要研究方法

FMT：將雄性C57BL/6J小鼠用于所有實驗，并在標準SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。 根據先前研究中描述的方法，從11名精神分裂癥患者（SCZ）和10名人口統(tǒng)計學匹配的健康對照（HC）中收集糞便樣本然后進行微生物菌群移植。簡而言之，將糞便懸浮在甘油-PBS液體中，收集后立即離心。混合來自患者或健康對照的含有微生物群的上清液，并用于移植。小鼠腸道菌群的消耗方法參考了之前兩項研究中描述的方法。最后一次飼喂抗生素后48小時，將小鼠隨機分為兩組，分別口服灌胃患者或對照組的微生物群懸液（10μl/g體重），持續(xù)3周以重建腸道菌群（以下稱為SCZ小鼠和HC小鼠）。行為測試：所有行為測試均在糞便移植后24小時進行。使用視頻計算機跟蹤系統(tǒng)對結果進行分析，或者通過手動觀察對結果進行評分。在兩個獨立的實驗中進行了兩節(jié)行為測試： 一種按曠場實驗（OFT），交互社會互動測驗（RSIT），三箱社交測驗（TCST），新奇事物識別測驗和強迫游泳測驗的順序進行；另一個按高架迷宮，巴恩斯迷宮（BM）和懸尾實驗的順序進行。給另外一組小鼠注射MK-801（0.2 mg/kg body weight, i.p.）或鹽水，并且它們在30分鐘后進行30分鐘的曠場實驗（OFT）。小鼠組織和糞便中的測定：在小鼠實驗期間的幾個時間點收集糞便顆粒（圖S1）。 對糞便樣本DNA進行宏基因組測序和16S rRNA擴增子測序。行為測試后24小時從小鼠體內解剖肝臟，脾臟和腸組織，并從小鼠大腦解剖前額葉皮質（PFC），紋狀體和海馬。分別采用ELISA、超高效液相色譜-串聯質譜法和qPCR測定上述組織中幾種代謝產物的濃度和色氨酸-Kyn-Kyna途徑中幾種代謝酶的mRNA水平。用ELISA試劑盒和Luminex免疫分析試劑盒檢測頸部標本血清內毒素、激素、色氨酸代謝產物和細胞因子。培養(yǎng)細胞和腦切片的檢測：在FMT結束時從SCZ小鼠和HC小鼠的結腸以及另外一組正常SPF小鼠的結腸中收集內容物。每組6只小鼠的混合結腸腔內容物以125微升/毫克的濃度懸浮于Hank平衡鹽溶液中，12000×g離心10min，用來自其上清液的結腸腔濾液（CLF）對體外培養(yǎng)的細胞和腦片進行刺激。將腦切片在含有SPF，HC或SCZ小鼠結腸腔濾液（CLF）或合并了PF-04859989和SCZ小鼠結腸腔濾液（CLF）或單純含有PF-04859989的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。從上述SPF環(huán)境中飼養(yǎng)的雄性C57BL/6J SPF小鼠（7-8周齡）中分離出混合結腸細胞和肝細胞，人永生化肝細胞（ATCC^?CRL-2706?）和人結腸癌細胞系HT-29（ATCC^?HTB-38?）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。為了確定結腸腔濾液（CLF）對酶mRNA和活性的影響，將上述細胞在含有來自SPF，HC或SCZ小鼠結腸腔濾液（CLF）的培養(yǎng)基中在37℃，5％CO₂條件下孵育24小時。

研究結果

● 糞菌移植可部分重現SCZ癥狀

我們通過給SPF C57BL/6小鼠提供10天的抗生素混合物，耗盡其體內的微生物群，然后將人SCZ患者和HCs的糞便灌胃給小鼠（圖S1）。對糞便DNA濃度和糞便16S rRNA基因拷貝數的定量分析表明，抗生素治療消除了大多數腸道微生物（圖S2a，b）。主坐標分析（PCoA）顯示，FMT后即刻、10天和14天的腸道微生物組與基線有顯著差異（圖S2c），這表明人類微生物很容易棲息在小鼠腸道中，并在某種程度上存活了至少2周。此外，接受SCZ患者糞便的小鼠體內的細菌群落與接受HCs糞便的小鼠體內的細菌群落是分開的。整個過程中體重增長，促炎細胞因子水平，血清中基礎皮質酮和內毒素的含量在兩組之間沒有顯著差異，我們觀察到主要器官的總體組織學無明顯變化（圖S3）。對SCZ和HC小鼠進行了大量的行為測試（圖1a）。與基線糞便相比，隨著移植后時間的延長，移植后收集的糞便微生物主要成分分離度降低，香農微生物多樣性差異減小（圖S2d），表明小鼠的人源化腸道微生物群逐漸消失?；诖?，我們在FMT后10天內完成了行為測試。SCZ小鼠在30分鐘的OFT測試中表現出運動過度行為，包括升高的飼養(yǎng)（圖1b）和增加的行進距離（圖1c，d）。當SCZ和HC小鼠被放置在監(jiān)視箱中時，它們的初始活動水平是相似的，但SCZ小鼠在正常的10分鐘適應期后仍繼續(xù)過度運動，即使在30分鐘后也沒有顯示出明顯的運動活性下降（圖1e）。在另一種由MK-801誘導的SCZ小鼠模型中，進一步研究了腸道菌群對運動的影響，結果表明MK-801和SCZ患者的腸道菌群均對運動產生顯著影響，并且在MK-801給藥后，SCZ小鼠的距離仍比HC小鼠增加（圖1f）。此外，SCZ小鼠在三箱社交測驗（TCST）中表現出更多的探索行為，例如延長的總探測時間（圖S4a）和長距離旅行（圖S4b），表明精神運動亢進。在開放式實驗箱中的交互社會互動中，與HC小鼠相比，SCZ小鼠對之間的交互作用的持續(xù)時間和頻率顯著提高（圖1g，h）。巴恩斯迷宮（BM）測試顯示，SCZ小鼠顯示出空間學習和記憶受損，因為它們在訓練過程中定位逃逸孔的等待時間更長（圖1i），并且在探針測試中在目標象限中花費的時間更少（圖1j）。此外，一項新的物體識別測試也表明，SCZ小鼠對先前探索過的物體記憶受損（圖1k）。

圖1 SCZ患者的腸道菌群誘導小鼠運動過度行為并損害學習和記憶

● SCZ小鼠色氨酸代謝的Kyn途徑上調

色氨酸代謝的微生物調節(jié)是腸道菌群調節(jié)大腦和行為的關鍵機制。飲食中的色氨酸主要通過兩種途徑吸收和分解代謝：Kyn途徑和5-羥色胺（5-HT）途徑（圖2a）。首先，我們確定色氨酸向Kyn和5-HT的外周分解代謝是否受到外來SCZ菌群的腸道定植的干擾。隨著移植小鼠腸道微生物群逐漸消失，我們在兩個時間點（即FMT之后和行為試驗之后（移植后10天））研究了色氨酸代謝產物。在SCZ小鼠中，FMT后血清色氨酸立即下降，行為試驗后繼續(xù)下降（圖2b）。在腸，脾和肝中，與HC小鼠相比，SCZ小鼠的色氨酸水平降低，這與在血清中觀察到的結果一致（圖S5a）。在FMT結束時，血清5-HT水平下降（圖S5b），而Kyn上升（圖2c），但在10天后恢復到正常水平。相對于HC小鼠，SCZ小鼠的腸道，脾臟和肝臟中也存在較高的Kyn（圖S5c）。由于Kyn代謝包括Kyna和3-羥基犬尿氨酸（3-HK，圖2a）兩個獨立的途徑，因此在小鼠中測量了血清和周圍組織中Kyna和3-HK的濃度，結果發(fā)現，與對照組相比，SCZ小鼠的血清，肝臟，結腸和脾臟中的Kyna水平持續(xù)升高（圖2d和S5d），而外周組織3-HK含量無差異（圖S5e）。這些數據表明，SCZ微生物群的定殖僅沿Kyn–Kyna途徑促進了色氨酸的代謝，并抑制了5-HT途徑。

色氨酸代謝受幾種限速酶的控制，其中一些酶受腸道微生物群的調節(jié)，我們發(fā)現，在SCZ小鼠的腸道、肝臟和脾臟中，催化Kyn產生的吲哚胺2,3-雙加氧酶1（IDO-1）和色氨酸2,3-雙加氧酶2（TDO-2）的mRNA水平高于正常水平（圖2e和S5f）。在催化Kyn轉氨為Kyna的四種犬尿氨酸氨基轉移酶（（KAT I-KAT IV）中，只有KAT II在SCZ小鼠的外周組織中過度表達（圖2f和S5g–i）。與腸道中5-HT的下調一致，色氨酸羥化酶1（TPH-1）在SCZ小鼠的腸壁中表達不足（圖S5j），相反，控制3-HK代謝途徑的犬尿氨酸3-單加氧酶（KMO）保持不變，與不受干擾的3-HK代謝一致（圖S5k）。

令我們驚訝的是，一些已知的IDO和TDO表達調節(jié)劑，例如促炎細胞因子，LPS和皮質酮，在SCZ小鼠中并未發(fā)生明顯變化（圖S3）。因此，我們假設腸道微生物群來源的因子，例如可溶性代謝產物，是導致色氨酸-Kyn-Kyna代謝途徑改變的原因。因此，我們檢測了SCZ小鼠結腸腔內容物的濾液，并評估了它們對培養(yǎng)的小鼠原代肝細胞和/或混合小鼠結腸細胞中這些酶的活性及其基因表達水平（IDO1、TDO2、KAT1-4和TPH1）的影響。有趣的是，來自SCZ小鼠的結腸腔內濾液（CLF）顯著促進了肝細胞和結腸細胞中IDO-1的活性和IDO1 mRNA的轉錄（圖2g和S6a）；SCZ小鼠的CLFs上調了培養(yǎng)的小鼠肝細胞中的KAT活性和KAT2 mRNA，但未上調結腸細胞中的KAT（圖2h和S6b）。此外，我們評估了CLFs在人類永生化肝細胞（CRL2706）和結腸上皮細胞（HT-29）中的作用，同樣，來自SCZ小鼠的CLF在兩種人類細胞類型中均顯著促進IDO1表達，僅在肝細胞中顯著促進KAT2表達（圖2i）。對結腸細胞或小鼠肝細胞表達的TDO-2和TPH-1的mRNA水平無明顯影響（圖S6c，d）。

圖2 移植了SCZ患者糞便的受體小鼠的外周組織色氨酸代謝受到干擾

● SCZ小鼠大腦中Kyn–Kyna代謝升高和神經遞質改變

外周組織中的色氨酸和Kyn能夠通過血腦屏障影響腦內穩(wěn)態(tài)。因此，在外周組織中的水平可影響其在腦中的下游代謝，并對中樞神經免疫和神經進行性過程產生影響。因此，我們進一步研究了腸道菌群對中樞Kyn代謝和神經遞質代謝的影響。行為測試后我們測量了前額葉皮質（PFC），紋狀體和海馬中的色氨酸，Kyn，Kyna，3-HK，5-HT及其主要代謝物5-羥基-3-吲哚乙酸（5-HIAA），多巴胺（DA）及其代謝物羥基苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA），興奮性氨基酸谷氨酸和抑制性氨基酸4-氨基丁酸（GABA）的水平（表S2）。我們發(fā)現，在所有三個區(qū)域中，Kyn和Kyna的濃度均持續(xù)升高，而前額葉皮質（PFC）和紋狀體中的3-HK降低且DA增加，紋狀體和海馬中5-HT增加，PFC中的谷氨酸和色氨酸增加（圖3a-c和S7）。Kyna而不是3-HK與它的前體Kyn高度正相關，前體Kyn可以從血液自由進入大腦（相關系數：0.831-0.909；圖3a-c中最右邊的圖）。在每個大腦區(qū)域內，這些色氨酸代謝產物與神經遞質之間存在著許多顯著的相關性（圖S8），其中最值得注意的是，Kyn / Kyna水平與PFC中的谷氨酸，紋狀體中的DA以及海馬中的谷氨酸和色氨酸呈正相關（圖S7），中樞色氨酸代謝產物和神經遞質也與小鼠行為相關（表S1），此外，我們發(fā)現，PFC中的Kyna與認知功能之間顯示出最強的負相關性（圖3d和e）。

外周組織色氨酸，Kyn或Kyna與前額葉Kyn或Kyna以及血清Kyna和紋狀體3-HK之間存在顯著相關性（圖S9a-g和表S3）。其次，我們比較了色氨酸代謝途徑中限速酶在SCZ小鼠和HC小鼠皮質的表達。我們發(fā)現，與HC小鼠相比，SCZ小鼠在三個腦區(qū)的KAT2 mRNA轉錄增加，海馬區(qū)的TPH1 mRNA轉錄增加（圖3f，g），而IDO1、TDO2、KAT1、KAT3、KAT4和KMO的表達無顯著變化（圖10a-f）。為了進一步確定腸道菌群對中樞Kyn代謝的影響是否直接，我們評估了CLFs對器官型皮質切片培養(yǎng)物中色氨酸–Kyn– Kyna代謝途徑和神經遞質水平的影響。在來自SCZ，HC或SPF小鼠的CLF存在下，將小鼠前腦皮質切片與腹側被蓋區(qū)/黑質體（VTA / SN）復合體離體共培養(yǎng)。與來自SPF或HC小鼠的CLF相比，來自SCZ小鼠的CLF顯著促進了KAT2表達和Kyna合成，但降低了腦切片中的3-HK水平（圖3h-j）。此外，SCZ小鼠的CLFs上調了這些腦片中的基礎DA水平（圖3k），而CLFs對腦片中KMO的表達沒有顯著影響（圖S10g）。有趣的是，KAT-II酶抑制劑PF-04859989顯著抑制SCZ小鼠CLFs對Kyna和DA濃度的調節(jié)作用，因為它顯著降低SCZ-CLFs處理的切片中Kyna和DA的濃度（圖3i，k），然而，PF-04859989對SCZ-CLFs誘導的腦切片中3-HK的減少沒有顯著影響（圖3j）。

圖3  SCZ患者的腸道菌群干擾了中樞色氨酸的代謝和神經遞質

● SCZ小鼠的腸道微生物改變及其與行為和神經遞質改變的關系

為了鑒定導致SCZ小鼠中這些神經化學物質和行為改變的微生物，我們對來自SCZ和HC小鼠的54份糞便樣本以及人類供體（患者和對照）的糞便樣本進行了宏基因組測序。除去低質量序列和小鼠序列后，每只小鼠平均獲得了7.49 Gb的人源細菌基因組測序數據（表S4）。種水平上的分類學組成以宏基因組操作分類單位（mOTU）為特征。種水平的mOTU的PCoA證實了SCZ和HC小鼠之間群落明顯分離（圖4a）。在供體糞便中存在的261個 mOTU中，受體小鼠的腸內存在112 個mOTU，SCZ和HC小鼠之間有55個 mOTU相對豐度有顯著差異（圖4b和表S5）。在這些差異富集的mOTU中，最終確定了30個mOTU，包括Parabacteroides distasonis、Parabacteroides merdae、Bacteroides eggerthii、Odoribacter splanchnicus、Fusobacterium ulcerans、Odoribacter splanchnicus、Clostridium scindens、Sutterella wadsworthensis等（圖4c）。來自差異富集的mOTU的功能基因被注釋到KEGG數據庫中， 78個KEGG模塊在兩組小鼠之間的相對豐度上有顯著變化（圖4d和表S6）。

圖4 移植了SCZ患者糞便的受體小鼠腸道微生物組和功能改變

 

有趣的是，色氨酸的生物合成功能在HC小鼠的糞便微生物組中顯著豐富，這與SCZ小鼠中色氨酸水平的降低相一致。此外，兩組小鼠之間大多數差異富集的mOTU均與色氨酸或其代謝產物，或大腦和血清中的神經遞質顯著相關（圖5），突出了腸道細菌對大腦色氨酸代謝和神經化學物質的調節(jié)作用。

圖5  SCZ小鼠中富集或減少的mOTU與腦中色氨酸及其代謝產物和神經遞質的關聯

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