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微衛(wèi)星分型誰更強(qiáng)？這篇論文幫你忙

發(fā)稿時間：2020-05-09來源：天昊生物

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的文章探討測序方法而不是傳統(tǒng)PAGE或毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行SSR分型的優(yōu)勢。今天就給大家推薦一篇剛發(fā)表的文章，相信會對您有所啟發(fā)。

題目：Fast Sequence-Based Microsatellite Genotyping Development Workflow

基于序列的微衛(wèi)星（SSR）基因分型快速開發(fā)流程

發(fā)表期刊：PeerJ 發(fā)表時間：2020-5-4 影響因子：2.35

研究內(nèi)容速覽：

基于高通量測序技術(shù)的SSR基因分型(SSRseq)，已被證明可以去除基于電泳方法的許多局限性，并改進(jìn)對群體的遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)的推斷。本文展示了簡化的SSRseq開發(fā)流程，包括SSR開發(fā)、多重SSR標(biāo)記擴(kuò)增和測序以及自動化的生信數(shù)據(jù)分析。研究舉例說明了該方法在不同門(真菌、植物、昆蟲和魚類)物種中的應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依賴先前開發(fā)的SSR標(biāo)記的分析并不是最佳方案，獲得可靠的基因座分型數(shù)目低。相比之下，全新的特殊引物設(shè)計(jì)方法，提供了高度多重的SSR分析，可以測序產(chǎn)生20-40個基因座的高質(zhì)量基因型。這里強(qiáng)調(diào)了前期開發(fā)因素在進(jìn)行有效SSRseq重要性。利用測序分析能夠快速產(chǎn)生出強(qiáng)大的基于多等位基因型的數(shù)據(jù)集，需要通過新的理論和分析框架來從多態(tài)性標(biāo)記系統(tǒng)中提取更多有用信息。

研究背景

在高通量測序技術(shù)的時代，與勢頭越來越猛的SNP多態(tài)性基因分型相比，高通量測序技術(shù)在SSR基因分型方面的應(yīng)用一直落后。傳統(tǒng)的基于毛細(xì)管電泳的SSR基因分型有幾個缺點(diǎn)：相似性(相同大小的等位基因具有潛在的不同序列)、耗時耗力的開發(fā)和基因分型、低通量、缺乏自動化和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等。而所有這些限制都是由于目前SSR基因分型依賴于毛細(xì)管電泳的擴(kuò)增子片段大小來識別等位基因，如果SSR基因分型轉(zhuǎn)變?yōu)榛谛蛄械幕蚍中蛣t會不同。以前對毛細(xì)管電泳和基于序列的SSR基因分型(SSRseq)的直接比較證實(shí)SSRseq是一種可靠的方法?；谛蛄械腟SR基因分型優(yōu)于基于毛細(xì)管電泳的SSR基因分型，可以直接獲取等位基因序列揭示了額外的多態(tài)性，當(dāng)僅使用等位基因大小來識別變異時，這些多態(tài)性仍然是隱藏的。因此，序列數(shù)據(jù)降低了等位基因的相似性，因?yàn)橄嗤笮〉牡任换蚩赡馨荒苻D(zhuǎn)化為大小變異的分子變異，如SNP多態(tài)性、不存在掩蓋重復(fù)數(shù)目的變異或存在兩個具有互補(bǔ)大小變異的相鄰SSR基序。因此，SSRseq提供了精確的遺傳多樣性估計(jì)和種群結(jié)構(gòu)推斷(Darby et al., 2016; Bradbury et al., 2018; Neophytou et al., 2018; Viruel et al., 2018; Layton et al., 2020)。

更新SSR基因分型以適應(yīng)現(xiàn)代技術(shù)仍然很重要。首先，生態(tài)學(xué)或進(jìn)化生物學(xué)中的當(dāng)前一些科學(xué)問題仍用十幾到上百的高度多態(tài)性多等位基因座位。第二，重復(fù)寡核苷酸基序數(shù)量的變化是一種獨(dú)特的多態(tài)性，具有特定的突變機(jī)制和速率，其本身對跨群體和跨基因組核苷酸替換的遺傳變異提供了必要補(bǔ)充。第三，越來越明顯的是，SSR多態(tài)性涉及許多生物學(xué)過程，如基因表達(dá)調(diào)控和表觀遺傳機(jī)制，以及更普遍的表型變異。因此，隨著時間的推移進(jìn)和技術(shù)進(jìn)步，在一段時間內(nèi)，標(biāo)記主導(dǎo)基因分型的偏好性在不斷演變，在高通量測序技術(shù)背景下，對任何類型標(biāo)記多態(tài)性的檢測都是重要且應(yīng)該優(yōu)先考慮。

迄今為止，人們已經(jīng)探索了SSRseq的具體技術(shù)和分析，開發(fā)了幾種生物信息學(xué)方法，測試了不同的實(shí)驗(yàn)方案，并在群體遺傳推斷中解釋分子變異的方法進(jìn)行了比較。總之，這些研究探索了許多關(guān)于SSRseq相對于傳統(tǒng)方法的技術(shù)和分析優(yōu)勢的問題。

在這里，研究者開發(fā)了一個應(yīng)用于非模型物種的SSRseq綜合流程分析，并將這一工作流程應(yīng)用于五個類群物種，它們在已經(jīng)獲得的基因組數(shù)據(jù)量上存在顯著差異。通過比較多種可能的開發(fā)方案，包括傳統(tǒng)上在毛細(xì)管測序儀上對已經(jīng)優(yōu)化的SSR分析進(jìn)行測序，優(yōu)化已經(jīng)開發(fā)的SSR周圍的引物，以及從一系列可用的基因組資源或從新生成的沒有現(xiàn)有基因組資源物種的低覆蓋率隨機(jī)基因組序列中重新開發(fā)SSR?；谝郧霸陂_發(fā)高度多重SSR基因分型方案方面的經(jīng)驗(yàn)，本研究提出了一種簡化的方法，并證明了其在具有廣泛遺傳和進(jìn)化特征的物種群體中的應(yīng)用。研究者應(yīng)用了一個SSR序列數(shù)據(jù)分析管線來產(chǎn)生單倍型數(shù)據(jù)，說明在測序等位基因中檢測到的所有多態(tài)性，通過廣泛的基因分型雙盲重復(fù)來驗(yàn)證，以估計(jì)SSRseq錯誤率。結(jié)論表明高效和強(qiáng)大的基于多態(tài)性單倍型的基因分型方法易于開發(fā)和應(yīng)用。

研究方法

研究物種、SSRseq開發(fā)策略和DNA提取

本研究選擇物種、SSRseq開發(fā)策略和DNA提取相關(guān)信息如表1所示。采用以前開發(fā)的SSR、SSR引物重新設(shè)計(jì)，或者從各種基因組資源中重新開發(fā)。

表1、本研究所用物種的SSRseq開發(fā)策略和DNA提取相關(guān)信息。

SSR的從頭開發(fā)及引物重新設(shè)計(jì)

利用前人開發(fā)的QDD管線對(i)參考基因組序列，(ii)一組低覆蓋率隨機(jī)序列或(iii)已經(jīng)表征SSR基因座的序列進(jìn)行提取分析(表2)，從一些低復(fù)雜性等有問題的序列中鑒定出高質(zhì)量序列，并在SSR兩側(cè)設(shè)計(jì)引物對(圖1)。QDD管線以默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行，引物最佳大小設(shè)定為25 bp(最小21 bp，最大26 bp)，最佳退火溫度設(shè)定為68℃(最小60℃，最大75℃)，同一對引物之間的最大差異為10℃，GC最佳百分比為50%(最小40%，最大60%)。此外，PCR產(chǎn)物大小設(shè)置在120到200 bp之間，以便與廣泛的測序平臺兼容，并產(chǎn)生可用于分析降解或低量DNA樣品的基因分型分析。QDD分析產(chǎn)生了大量具有設(shè)計(jì)引物對的候選基因座，從中可以選擇有限數(shù)量的基因座(圖1)。除了Quercus sp.，當(dāng)有數(shù)百到數(shù)千個候選SSR時，參考Meglécz et al.在2014年的建議，使用幾個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)從中選擇60個SSR用于進(jìn)一步測試，包括：通過從單體而非共有序列中選擇SSR，對擴(kuò)增成功可能性增加的引物對進(jìn)行優(yōu)先排序，選擇單一重復(fù)而非多個基序序列，在引物和重復(fù)基序之間顯示至少20 bp，側(cè)翼區(qū)域顯示高度復(fù)雜性(例如，沒有微小衛(wèi)星（minisatellite），側(cè)翼區(qū)域沒有其他SSR，側(cè)翼區(qū)域或引物沒有同聚物)。此外，我們進(jìn)一步選擇具有最高重復(fù)數(shù)的SSR，以增加選擇多態(tài)性位點(diǎn)的概率，避免可能形成發(fā)夾的基序，如at重復(fù)，并在可能時包括多種二、三和四核苷酸重復(fù)。

表2、SSRseq基因分型的測試方案摘要。

圖1、SSRseq標(biāo)記優(yōu)化或開發(fā)工作流程。

引物修飾和簡單擴(kuò)增試驗(yàn)

根據(jù)Ion Torrent和Illumina測序平臺要求設(shè)計(jì)添加了Tag的引物(表2)，使用Primer Pooler軟件進(jìn)行引物二聚體形成分析。顯示deltaG 低于-6 kcal/mol的引物對很可能形成二聚體，導(dǎo)致不良的多重PCR擴(kuò)增。對于參與重要相互作用的基因座，選擇備選引物，或者在沒有備選引物的情況下，從候選名單中選擇另一個基因座。之后進(jìn)行簡單擴(kuò)增試驗(yàn)，跑瓊脂糖凝膠選取清晰條帶引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

多重SSR擴(kuò)增和測序文庫的構(gòu)建

本研究分析了192至960個個體，包括46至156個重復(fù)個體，以檢查方法的可重復(fù)性(表2)。對于每個分組樣本，使用三輪多重PCR方法同時擴(kuò)增所有基因座，并提高擴(kuò)增的同質(zhì)性，從而覆蓋基因座之間的序列。

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用FastQC對序列進(jìn)行質(zhì)控，使用cutadapt去除小于70 bp的讀序，使用pear組裝成contigs，最小重疊為50 bp，最大組裝序列長度為450 bp。

使用FDSTools管線對每個個體進(jìn)行SSR分型，并獲得基因型相對應(yīng)的序列(圖1)。之所以選擇這種分析工具，是因?yàn)樗紤]了在分析序列中檢測到的任何類型的多態(tài)性(包括重復(fù)基序、SNP或indels)，同時整合了特定的工具，可從擴(kuò)增過程的滑移突變中檢測真正的等位基因。

對于每個基因座，使用以下標(biāo)準(zhǔn)按重要性順序確定最佳分析策略：估計(jì)等位基因誤差、缺失基因型數(shù)量和檢測到的等位基因數(shù)量。超過6%的等位基因誤差或超過50%的個體缺失數(shù)據(jù)的基因座被標(biāo)記為失敗，并從進(jìn)一步的檢查中移除。

基于序列信息(單倍型)鑒定的等位基因的數(shù)量與僅在所有分析的基因座中擴(kuò)增子長度不同的等位基因的數(shù)量進(jìn)行比較，以評估通過使用序列數(shù)據(jù)獲得的信息的增益和估計(jì)大小的同質(zhì)性。我們通過對每個基因座的重復(fù)數(shù)、重復(fù)基序中的SNP和indels，以及單倍型之間不同側(cè)翼區(qū)的變異數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)一步研究了檢測到的多態(tài)性的性質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

利用先前開發(fā)的SSR的基于序列的基因分型

從S. salar先前開發(fā)的SSR使用基因座的多重組合進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)可靠基因座的基因型數(shù)量較少，總成功率在39%到47%之間，可靠基因座的數(shù)量在7到10之間(表2)。此外，生成的基因型數(shù)據(jù)集的質(zhì)量相對較低，缺失數(shù)據(jù)率和等位基因誤差分別高于10%和1%(圖2)。在Ion Torrent PGM平臺上的序列獲得最低的基因型數(shù)據(jù)質(zhì)量，而盡管在Illumina MiSeq平臺上對每個個體每個測序基因座產(chǎn)生的的平均覆蓋率低2.3倍，但是卻獲得了更高的基因分型質(zhì)量，具有更低的缺失數(shù)據(jù)和等位基因錯誤率(圖2，表2)。Ion Torrent平臺的最低性能是由于同聚物片段周圍虛假插入-缺失相關(guān)的較高測序錯誤率，這導(dǎo)致了測序讀序的浪費(fèi)，噪聲的增加。因此選擇Illumina MiSeq測序平臺用于其他物種的后續(xù)分析。

圖2、先前開發(fā)的微衛(wèi)星的SSRsq開發(fā)結(jié)果。S. salar中一個由23個SSR組成新的多重序列，分別用 (a) Ion Torrent PGM測序平臺，(b)Illumina MiSeq測序平臺，和(c) 由15個SSR組成的用Illumina MiSeq測序平臺的常規(guī)測序結(jié)果。對整個序列的所有多態(tài)性（Full length），或者僅關(guān)注重復(fù)基序內(nèi)的多態(tài)性（Repeat focused），或者針對每個基因座的最佳策略的組合（Combined）的可靠基因座的數(shù)量、等位基因的總數(shù)、缺失數(shù)據(jù)和等位基因錯誤率進(jìn)行分析。

從頭開發(fā)的SSR序列基因分型

相比之下，從頭開發(fā)SSR的總成功率在67%到86%不等(表2)。鑒于通常從高通量測序或參考基因組序列中鑒定出的大量候選SSR，我們能夠篩選出多達(dá)60個新的基因座，并將其中的大多數(shù)(從28個到60個)在單個多重PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增(表2)。

全序列與重復(fù)基序多態(tài)性比較分析

將分析集中在重復(fù)的基序上稍微增加了可靠基因座的數(shù)量，并且傾向于產(chǎn)生稍微更少的缺失數(shù)據(jù)和等位基因錯誤(圖3)。然而，側(cè)翼序列中可能存在的許多多態(tài)性沒有被解釋。事實(shí)上，分析在PCR反應(yīng)引物之間檢測到的所有多態(tài)性導(dǎo)致每個基因座的平均等位基因數(shù)更高，代價(jià)是丟失數(shù)據(jù)和等位基因錯誤率稍高(圖3)。有趣的是，17%的基因座可以用全長或重復(fù)聚焦的分析方法進(jìn)行可靠的分析。因此，通過為每個位點(diǎn)選擇最佳方法來組合分析策略，得到優(yōu)化的數(shù)據(jù)集(圖3)。即使對于具有可靠基因型的基因座，不管所選擇的分析方法如何，選擇產(chǎn)生最佳質(zhì)量數(shù)據(jù)(就等位基因數(shù)量、缺失數(shù)據(jù)和錯誤率而言)的基因座會提高數(shù)據(jù)集質(zhì)量。這種組合策略導(dǎo)致最高數(shù)量的基因座和等位基因，同時將缺失數(shù)據(jù)和等位基因錯誤率保持在最低水平(圖3)。

圖3、基于新優(yōu)化的SSR的SSRseq開發(fā)結(jié)果。

用Illumina MiSeq測序平臺對(a) Quercus sp.，(b) Alosa sp.，(c) A. ostoyae， (d) M. variegatipes進(jìn)行檢測，對整個序列的所有多態(tài)性（Full length），或者僅關(guān)注重復(fù)基序內(nèi)的多態(tài)性（Repeat focused），或者針對每個基因座的最佳策略的組合（Combined）的可靠基因座的數(shù)量、等位基因的總數(shù)、缺失數(shù)據(jù)和等位基因錯誤率進(jìn)行分析。

跨物種檢測到的多態(tài)性類型

雖然大多數(shù)常見的群體遺傳學(xué)應(yīng)用不需要描述區(qū)分等位基因的多態(tài)性的性質(zhì)，但是序列數(shù)據(jù)的主要優(yōu)勢(除了分析更多數(shù)量的基因座之外)是能夠識別不轉(zhuǎn)化為大小變異的等位基因變異，即使用經(jīng)典電泳方法時檢測到的唯一變異。除了重復(fù)數(shù)目的變異，研究者還在側(cè)翼序列或重復(fù)基序本身中鑒定了許多SNP和indels (圖4，表3)。

表3、檢測到多態(tài)性。

圖4、每個物種組中每個樣品在重復(fù)基序或側(cè)翼序列中檢測到的多態(tài)性類型的比例。

研究結(jié)論：

本研究提出了一個綜合的方法來加速非模式物種的SSRseq協(xié)議的開發(fā)，并提供了一些提高開發(fā)效率的建議。兩個最重要的建議是優(yōu)化標(biāo)記選擇和引物設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)有效的多重聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增和序列可解釋性，并使用重復(fù)個體來評估產(chǎn)生的基因型數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

本研究選擇Illumina的384個條形碼組合，因?yàn)檠芯空邔?0到300個位點(diǎn)進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)它與MiSeq測序平臺的輸出非常吻合。然而，當(dāng)研究單個物種中超過384個個體時，需要多次MiSeq運(yùn)行或定制的雙重索引策略，可在Ion Torrent PGM運(yùn)行(使用了960種條形碼組合)，或之前使用MiSeq平臺的研究(960種和1，024種條形碼組合。

除了靶向SSR外，SSRseq表征序列中存在的SNP和indel的能力代表了一個新的機(jī)會，可以產(chǎn)生經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來應(yīng)用現(xiàn)有的理論和統(tǒng)計(jì)框架，將連鎖多態(tài)性與不同的突變特征結(jié)合起來。依賴于比通過自動化生物信息學(xué)管線的傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳基因分型更容易標(biāo)準(zhǔn)化的序列數(shù)據(jù)的基因分型將促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)共享和增加基因分型數(shù)據(jù)庫，這對野生動物監(jiān)測的應(yīng)用至關(guān)重要。

最后，多物種并行開發(fā)的便利性使得這些方法便于開發(fā)用于比較種群和群落遺傳學(xué)研究的強(qiáng)大的多位點(diǎn)數(shù)據(jù)集，并進(jìn)一步研究自然種群中SSR變異的功能含義和適應(yīng)潛力。

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