客戶文章 | 天昊MethylTarget?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序技術(shù)在雞膽固醇沉積研究中的應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2020-05-21來源：天昊生物

 

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院近期在家禽學(xué)雜志《Poultry Science》上發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)母體甜菜堿的補(bǔ)充可以調(diào)節(jié)SREBP2和CYP7A1基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平，進(jìn)而降低雞后代的肝膽固醇沉積。本研究采用了MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序技術(shù)，在恭喜客戶文章發(fā)表的同時(shí)，我們也跟大家一起分享下本文的研究思路。英文題目：Maternal betaine supplementation decreases hepatic cholesterol deposition in chicken offspring with epigenetic modulation of SREBP2 and CYP7A1 genes中文題目：母體甜菜堿的補(bǔ)充調(diào)控SREBP2和CYP7A1基因表觀遺傳來降低雞后代肝膽固醇的沉積期刊名：Poultry Science影響因子：2.027發(fā)表時(shí)間：2020-4-14

研究摘要

有研究表明，哺乳動(dòng)物母體中的甜菜堿可以調(diào)控后代的肝膽固醇代謝，然而給蛋雞喂食甜菜堿如何影響后代雞的肝臟膽固醇代謝尚不清楚。本研究給如皋黃羽蛋雞(n = 120)飼喂基礎(chǔ)日糧或添加0.5%甜菜堿的日糧28天，然后收集雞蛋進(jìn)行孵化。結(jié)果顯示，母雞中的甜菜堿顯著降低子代雞肝臟膽固醇含量。膽固醇生物合成酶、甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白2 (SREBP2)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶降低，而將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)在甜菜堿處理的子代雞中的mRNA和蛋白質(zhì)水平均增加。甜菜堿處理組肝臟低密度脂蛋白受體的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，而介導(dǎo)膽固醇酯化的膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1的mRNA豐度顯著降低。同時(shí)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白含量增加，這與受影響膽固醇代謝基因CpG甲基化的改變有關(guān)。此外，甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白2的基因啟動(dòng)子上的CpG甲基化水平增加，而膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1的豐度降低。這些結(jié)果表明，對(duì)母雞甜菜堿的補(bǔ)充可以通過對(duì)后代幼雞膽固醇代謝基因的表觀遺傳調(diào)節(jié)，顯著降低肝臟膽固醇沉積。

 

研究背景

膽固醇對(duì)細(xì)胞活力和功能至關(guān)重要，肝臟是膽固醇代謝的主要場(chǎng)所，而膽固醇及其代謝產(chǎn)物水平與雞脂肪肝綜合征疾病有關(guān)，嚴(yán)重影響蛋雞的健康和生產(chǎn)效率，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，控制肝臟膽固醇代謝將有益于雞的健康和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的預(yù)防策略。

肝臟中膽固醇代謝的體內(nèi)平衡取決于膽固醇生物合成和轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)平衡。SREBP2是激活膽固醇生物合成基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(HMGCR)。膽固醇可以通過CYP7A1轉(zhuǎn)化為可排泄的膽汁酸而被分解。許多研究表明，SREBP2和CYP7A1是調(diào)節(jié)后代膽固醇代謝的關(guān)鍵因素，以應(yīng)對(duì)母體營養(yǎng)干預(yù)。在雞中，探索蛋雞后代中的SREBP2和CYP7A1表達(dá)是否易受母體營養(yǎng)狀態(tài)的影響是很有意義的。

甜菜堿是甘氨酸的三甲基衍生物，可直接從飲食中獲得，或通過氧化從飲食膽堿中間接獲得。甜菜堿可以通過一個(gè)碳代謝激活DNA甲基化，從而調(diào)節(jié)膽固醇代謝基因的轉(zhuǎn)錄。最近的研究提供了證據(jù)，表明母體甜菜堿暴露增加了肝膽固醇的積累以及CYP7A1基因啟動(dòng)子的高甲基化。值得注意的是，母雞日糧中添加甜菜堿會(huì)引發(fā)后代雞SREBP2和HMGCR基因啟動(dòng)子的低甲基化，導(dǎo)致下丘腦膽固醇含量升高。本文研究者以前曾報(bào)道過，卵內(nèi)注射甜菜堿可通過表觀遺傳基因調(diào)節(jié)來減輕幼年雞體內(nèi)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的肝膽固醇沉積。然而，當(dāng)母雞飼喂甜菜堿時(shí)，表觀遺傳修飾是否參與了后代雞肝臟膽固醇代謝基因轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)仍不清楚。

因此，本研究的目的是調(diào)查母雞日糧中添加甜菜堿是否能調(diào)節(jié)子代幼雞的肝臟膽固醇代謝，以及這種影響如何與SREBP2和CYP7A1基因啟動(dòng)子上的DNA甲基化相關(guān)。

 

材料和方法

將38周齡的120只如皋黃羽母雞隨機(jī)分為對(duì)照組和甜菜堿組，每組包含60只母雞，在20個(gè)籠子里(每個(gè)籠子3只母雞)，飼喂基礎(chǔ)日糧(對(duì)照)或添加0.5%甜菜堿的日糧(甜菜堿組)，為期4周。記錄初始體重和產(chǎn)蛋能力。在飲食處理后的第18天和第24天對(duì)雞進(jìn)行人工授精。從每組收集200個(gè)在飲食處理的最后4天(第25-28天)產(chǎn)下的雞蛋。小雞在保育箱中孵化，一日齡的小雞被單獨(dú)稱重。所有的小雞都喂食相同的食物。從孵化到56日齡，每周記錄生長表現(xiàn)。在57日齡時(shí)，從每組中選擇30只雄性雞(每組15只)，稱重后處死，采集血樣，分離血漿，并在-20℃下儲(chǔ)存。肝臟(無膽囊)樣品在液氮中快速冷凍，并保持在-80℃下待進(jìn)一步分析。

之后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)包括肝臟和血漿的膽固醇含量測(cè)定，以及RT-PCR、WB、MeDIP實(shí)驗(yàn)，并采用天昊MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序技術(shù)，對(duì)目的基因啟動(dòng)子的CpG甲基化進(jìn)行了亞硫酸氫鹽測(cè)序分析。

 

研究結(jié)果

體重、肝臟重量、血清膽固醇和HDL-C濃度、肝臟膽固醇含量母體甜菜堿對(duì)后代雞的體重(圖1A)和肝臟重量(圖1B)沒有顯著影響。然而，添加甜菜堿的雞的后代在血漿(圖1C)和肝臟(圖1F)中的膽固醇濃度顯著降低。此外，與對(duì)照組相比，補(bǔ)充母體甜菜堿顯著降低了血漿中HDL-C含量(圖1D)。血漿中的LDL-C濃度沒有明顯變化 (圖1E)。

 

圖1、補(bǔ)充母體甜菜堿對(duì)仔雞體重、肝臟重量、血漿膽固醇濃度和肝臟總膽固醇含量的影響。

 

膽固醇代謝相關(guān)基因在肝臟中的表達(dá)在甜菜堿處理的雞的后代中，甜菜堿引起肝臟膽固醇生物合成基因SREBP2、HMGCR和膽固醇分解代謝基因CYP7A1及ACAT1和LDLR在mRNA(圖2A)和蛋白質(zhì)(圖2B)水平的顯著表達(dá)，其他膽固醇代謝基因在基因水平未檢測(cè)到顯著變化。

圖2、甜菜堿對(duì)幼雞肝臟膽固醇代謝基因表達(dá)的影響。

 

蛋氨酸循環(huán)和甲基轉(zhuǎn)移基因的肝蛋白含量在蛋氨酸循環(huán)中涉及的4種酶中，甜菜堿的補(bǔ)充顯著增加甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)和腺苷同型半胱氨酸酶樣1 (AHCYL1)的肝蛋白含量(圖3A)。此外，甜菜堿處理的后代雞的肝臟中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1)的蛋白質(zhì)含量顯著增加(圖3B)。甜菜堿處理雞的后代中，蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2B (MAT2B)、甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GNMT)和脫氧核糖核酸甲基轉(zhuǎn)移酶3a (DNMT3a)的肝蛋白含量無顯著變化。

圖3、補(bǔ)充母體甜菜堿對(duì)碳代謝甲基轉(zhuǎn)移相關(guān)酶類肝蛋白含量的影響。

 

肝臟中SREBP2、CYP7A1和ACAT1基因啟動(dòng)子的CpG甲基化對(duì)從肝臟分離的基因組DNA的MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序分析顯示，SREBP2、CYP7A1和ACAT1基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG甲基化狀態(tài)受母體甜菜堿喂養(yǎng)的調(diào)節(jié)。對(duì)于SREBP2基因啟動(dòng)子，分析了CpG島的兩個(gè)區(qū)域(圖4A)。片段1跨越翻譯起始密碼子ATG上游-2030到-1612，包含13個(gè)CpG位點(diǎn)，而片段2跨越-3384到-2987，包含12個(gè)CpG位點(diǎn)。與對(duì)照組相比，甜菜堿組片段1上的7個(gè)CpG位點(diǎn)顯著高甲基化，片段2上的9個(gè)CpG位點(diǎn)顯著高甲基化，而片段2上的2個(gè)CpG位點(diǎn)為低甲基化 (圖4B、4C)。同時(shí)，MeDIP結(jié)果證實(shí)，在甜菜堿處理的雞的后代中，SREBP2啟動(dòng)子顯著高甲基化(圖4D)。

圖4、肝臟中SREBP2基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。

 

對(duì)CYP7A1基因啟動(dòng)子分析了1個(gè)片段(圖5A)。該片段位于翻譯起始密碼子ATG的上游-282到-53，包含7個(gè)CpG位點(diǎn)。在甜菜堿組中，在CYP7A1基因啟動(dòng)子上檢測(cè)到的7個(gè)CpG位點(diǎn)中有6個(gè)是低甲基化(圖5B)。MeDIP結(jié)果顯示，在甜菜堿處理的雞的后代中，CYP7A1啟動(dòng)子顯著地低甲基化 (圖5C)。

圖5、肝臟中CYP7A1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。

 

對(duì)ACAT1基因啟動(dòng)子分析了1個(gè)片段(圖6A)。該片段位于翻譯起始密碼子ATG的上游-483到-269，包含19個(gè)CpG位點(diǎn)。在ACAT1基因啟動(dòng)子上檢測(cè)到的19個(gè)CpG位點(diǎn)中有7個(gè)是高甲基化，在甜菜堿組中19個(gè)CpG位點(diǎn)中有1個(gè)是低甲基化的(圖6B)。MeDIP結(jié)果顯示，在甜菜堿組中，ACAT1基因啟動(dòng)子顯著高甲基化(圖4C)。

圖6、肝臟中ACAT1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。

 

總的來說，在所有檢測(cè)到的片段中，SREBP2、CYP7A1和ACAT1基因啟動(dòng)子的平均甲基化率分別與它們的mRNA豐度成反比。

 

研究結(jié)論

本研究證明了母體甜菜堿的補(bǔ)充可以改變對(duì)膽固醇代謝基因的表觀遺傳，進(jìn)而降低子代幼雞肝臟中的膽固醇含量。

昊技術(shù)

天昊MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序技術(shù)：

§  性價(jià)比高：傳統(tǒng)克隆測(cè)序一個(gè)片段10個(gè)克隆的價(jià)格，MethylTarget可以完成約60個(gè)片段的檢測(cè)（檢測(cè)深度為1000X，相當(dāng)于1000個(gè)克?。?。

§  精確度高：基于二代測(cè)序數(shù)據(jù)檢測(cè)甲基化程度，精確到單堿基分辨率，與基于測(cè)序的全基因組甲基化測(cè)序，RRBS數(shù)據(jù)有高度一致性。

§  精確定量：測(cè)序深度高達(dá)1000X，并可以進(jìn)一步加深，相比于傳統(tǒng)克隆測(cè)序，可以對(duì)位點(diǎn)甲基化程度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

§  技術(shù)靈活：基于多重PCR富集進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域富集，可隨時(shí)進(jìn)行基因和位點(diǎn)的變化和改動(dòng)，并且可以獲得每個(gè)片段的甲基化單倍型。

 

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