微生物絕對定量研究知多少

發(fā)稿時(shí)間：2020-07-29來源：天昊生物

目前細(xì)菌群落研究常用的技術(shù)是16S相對定量擴(kuò)增子測序，而最近越來越多的研究者開始采用絕對豐度（即菌群的實(shí)際數(shù)量）對細(xì)菌群落進(jìn)行絕對定量研究，今天小編就微生物絕對定量研究的一些常見問題在此總結(jié)一下。

問答1

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絕對定量相對于常規(guī)16S相對定量擴(kuò)增子測序最大的優(yōu)勢是什么？

常規(guī)16S擴(kuò)增子測序方法能解析樣本中的物種組成和其相對豐度信息，因此對微生態(tài)研究具有重要的促進(jìn)作用。然而我們需要注意一點(diǎn)，那就是相對豐度并不能反映樣本每種微生物的真實(shí)數(shù)量和組間樣本的真實(shí)差異，這是為什么呢？這是因?yàn)橄鄬ωS度分析忽略了不同樣本之間總體微生物量存在的現(xiàn)實(shí)差異，造成了分析結(jié)果的偏差，而絕對定量分析則是計(jì)量樣本每種微生物的16S基因拷貝數(shù)或者數(shù)目，從而實(shí)現(xiàn)絕對定量，因此相對于常規(guī)16S相對定量擴(kuò)增子測序，絕對定量分析能反映樣本每種微生物的真實(shí)數(shù)量和組間樣本的真實(shí)差異，因此絕對定量分析相對于相對定量分析更能反映樣本細(xì)菌群落的真實(shí)變化，是進(jìn)行微生態(tài)研究的首選。

支持文獻(xiàn)1：Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load. Nature. 2017.551(7681):507-511.（該文章鏈接，請點(diǎn)擊：Nature：要想真正研究宿主-腸道微生物的相互作用，必須將相對定量變成絕對定量）

支持證據(jù)：

• 為了證明絕對定量數(shù)據(jù)（QMP）在臨床研究中的潛在作用，本研究對29例克羅恩病患者和健康人的樣本進(jìn)行絕對定量數(shù)據(jù)分析，流式細(xì)胞儀分析表明，克羅恩病患者糞便樣品中的細(xì)胞數(shù)比健康對照組低3倍（圖4a）。
• 發(fā)現(xiàn)只在應(yīng)用相對數(shù)據(jù)RMP分析時(shí)，擬桿菌Bacteroides與克羅恩病相關(guān)（圖4b左），僅在使用絕對定量數(shù)據(jù)QMP時(shí)，普雷沃菌屬Prevotella與克羅恩病相關(guān)（圖4b右）。
• 以上這些觀察強(qiáng)調(diào)了相對數(shù)據(jù)（RMP）分析的局限性：來源于相對數(shù)據(jù)（RMP）分析的一個(gè)錯(cuò)誤結(jié)果解釋可能提示擬桿菌Bacteroides在克羅恩病的發(fā)病或發(fā)展中的假因果關(guān)系，為什么會出現(xiàn)這種假因果關(guān)系，這是因?yàn)橄鄬Χ糠治龊鲆暳私】祵φ蘸涂肆_恩病患者腸道微生物總豐度的巨大差異（差3倍），通過人為抽平處理認(rèn)為樣本間微生物總豐度一致，從而造成上述錯(cuò)誤，因此本文認(rèn)為絕對定量數(shù)據(jù)（QMP）分析鑒定到的微生物總豐度降低才是引起克羅恩病患者腸道微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的根本原因。本文認(rèn)為目前大多數(shù)對于腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究并不能體現(xiàn)出具體微生物數(shù)量改變對宿主帶來的影響，這些相對豐度研究忽略了總體微生物豐度本身的改變可能是引起宿主產(chǎn)生疾病的主要原因這一可能性。所以，為了真正體現(xiàn)宿主-微生物群的相互作用，微生物群的研究必須將相對豐度變成絕對豐度。

支持文獻(xiàn)2：Absolute quantification of microbial taxon abundances. The ISME Journal. 2017.11(2):584-587. （該文章鏈接，請點(diǎn)擊：The ISME Journal：為什么微生物相對定量不能代替絕對定量）

支持證據(jù)：

• 本研究對核試驗(yàn)反應(yīng)堆上運(yùn)行的冷卻水回路系統(tǒng)進(jìn)行兩次40天調(diào)查（survey1和survey2），包括冷卻水系統(tǒng)沒有運(yùn)行的時(shí)間段（control），冷卻水系統(tǒng)啟動階段（start-up），冷卻水系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)運(yùn)行階段（operation）。
• 仔細(xì)檢查了兩個(gè)微生物分支betI-A分支和bacI-A分支的釋相對豐度和絕對豐度的時(shí)間軌跡時(shí)間軌跡（圖2）。結(jié)果檢測到兩個(gè)主要差異：1）：在群落成長期間，比如survey 1的start-up和早期 operation階段，絕對豐度有一個(gè)明確的過渡，顯示出bacI-A分支的生長和衰變；相反，在生長和衰變過程中，bacI-A分支的相對豐度則始終保持相對恒定，沒有任何過渡。2）：在survey2的operation后半部分，相對豐度曲線顯示從±40%增加到90%以上，暗示了betI-A分支的生長；相反，如果看絕對豐度，那么這個(gè)分支就沒有明顯的活躍生長，其細(xì)胞密度從未顯著超過start-up階段結(jié)束時(shí)觀察到的最大密度。
• 本文認(rèn)為微生物某一類群的富集（相對豐度比例的增加）不一定真正與相應(yīng)微生物類群生長（絕對豐度的增加）有關(guān)，可能是其它微生物類群的衰退導(dǎo)致了其在群落結(jié)構(gòu)中相對豐度比例的增長。

問答2

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既然絕對豐度更準(zhǔn)確，那么聯(lián)合常規(guī)16S相對定量擴(kuò)增子測序和總細(xì)菌qPCR獲得的絕對豐度可靠嗎？

qPCR是定量物種絕對豐度的金標(biāo)準(zhǔn)，但是針對存在于樣品中的每種細(xì)菌開發(fā)一套qPCR檢測方法顯然是不切實(shí)際的，因此很多老師經(jīng)常聯(lián)合常規(guī)16S相對定量擴(kuò)增子測序（獲取每個(gè)物種的相對豐度）和總細(xì)菌qPCR（獲取總細(xì)菌載量）來獲得每個(gè)物種的絕對豐度，總體而言，基于這兩種技術(shù)聯(lián)合推斷的特定物種的絕對豐度在某種程度上提供了一個(gè)機(jī)會來評估細(xì)菌物種的絕對豐度，但是有研究表明這種聯(lián)合只適合高豐度物種（物種的相對豐度大于10%）的絕對豐度推斷，當(dāng)物種的相對豐度較低時(shí)，這種聯(lián)合分析推斷的絕對豐度估計(jì)值很容易出錯(cuò)，并且可能在從低細(xì)菌豐度增殖時(shí)期和后期收縮到低豐度的過程中可能會歪曲單個(gè)物種的動力學(xué)。

支持文獻(xiàn)1：Complementing 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing with Total Bacterial Load To Infer Absolute Species Concentrations in the Vaginal Microbiome. mSystems. 2020.5(2):e00777-19.（該文章鏈接，請點(diǎn)擊：相對豐度會歪曲實(shí)際豐度，聯(lián)合16S擴(kuò)增子測序和總菌qPCR獲得的絕對豐度可靠嗎？）

支持證據(jù)：

• 本研究分析了來自20名有細(xì)菌性生殖道病史的女性的1320份樣本，通過獲取物種相對豐度（通過16S擴(kuò)增子測序獲得）和總細(xì)菌載量（通過細(xì)菌16S通用引物 qPCR獲得）的乘積來推斷每個(gè)細(xì)菌的絕對豐度，同時(shí)通過與物種靶向qPCR測定的陰道微生物組中7個(gè)關(guān)鍵物種的絕對豐度相比較來驗(yàn)證上述推斷的絕對豐度估計(jì)值的準(zhǔn)確性。
• 單一物種當(dāng)用qPCR檢測時(shí)，結(jié)果變化和擴(kuò)增子測序檢測結(jié)果變化不同，例如，對于圖1中所示的參與者，A. vaginae的絕對豐度在第17天（h 415）突然增加，但是相對豐度直到第28天（h 671），才顯示出突然增加。從第0天到第7天（h 168），受試者接受甲硝唑治療細(xì)菌性陰道炎（BV）：qPCR顯示BV相關(guān)物種的絕對豐度呈指數(shù)下降；然而，擴(kuò)增子測序則顯示受試者經(jīng)過治療更迅速地向Lactobacillus iners轉(zhuǎn)化。另外，擴(kuò)增子測序的相對豐度也無法捕獲細(xì)菌的低水平定植，例如擴(kuò)增子測序在第6至11天（h 150和261）不能發(fā)現(xiàn)Gardnerella vaginalis的定殖，而靶向qPCR則可以發(fā)現(xiàn)Gardnerella vaginalis的定殖。綜上，縱向剖面的比較再次說明相對豐度和絕對豐度之間確實(shí)存在很大差異。
• 本研究將推斷的絕對豐度值與七個(gè)關(guān)鍵物種的靶向qPCR所測量的絕對豐度進(jìn)行了比較，對于每個(gè)物種，在大多數(shù)樣品中推斷出的細(xì)菌絕對豐度與qPCR所測量的絕對豐度很類似（圖1c；圖2中的虛線）。在許多情況下，對于大多數(shù)物種，沒有明顯的極端不一致（圖2a）。然而，對于某些物種，如Megasphaera和BVAB2，推斷的細(xì)菌絕對豐度始終高于qPCR所測量的絕對豐度一個(gè)數(shù)量級（圖2b）。在一組樣本中，對于所有物種，推斷的細(xì)菌絕對豐度為零，而qPCR水平為正，導(dǎo)致推斷的細(xì)菌絕對豐度和qPCR所測量的絕對豐度之間的嚴(yán)重不一致：這通常在低絕對豐度情況下出現(xiàn)（圖2）。

問答3

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絕對定量分析的計(jì)算單位是用16S copies/g樣本還是用16S copies/ng DNA，哪個(gè)更準(zhǔn)確?

在實(shí)驗(yàn)條件允許情況下，建議采用樣本水平（采用16S copies/g糞便、16S copies/g土壤、16S copies/mL 水作單位）進(jìn)行后續(xù)群落分析，其結(jié)果也更符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，天昊生物豐富的16S擴(kuò)增子絕對定量測序項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)表明樣本水平的聚類效果要比DNA水平（16S copies/ng DNA）好，往往組間差異增大，組內(nèi)差異減小（見下圖）（小貼士：a,注意記錄抽提DNA時(shí)每個(gè)樣本所用量（即用了多少g 土壤/糞便或mL 水）；b,記錄每個(gè)樣本抽提獲得的DNA總量（即抽提出多少ng DNA），以上數(shù)據(jù)可以將測序獲得的16S copies/ ng DNA數(shù)值轉(zhuǎn)化成發(fā)表文章時(shí)所用的 16S copies/g樣本數(shù)值）。

問答4

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絕對定量分析得到的16S copies/g樣本數(shù)據(jù)和真實(shí)的微生物數(shù)目一致嗎?

無論是物種靶向qPCR絕對定量或者基于內(nèi)標(biāo)法的絕對定量測序得到的每克樣本的16S copies數(shù)據(jù)都與每克樣本中所包含的微生物細(xì)胞數(shù)是有差異的，原因是因?yàn)榇蟛糠治锓N中的16S RNA基因會有多個(gè)拷貝，并且不同物種的16S RNA基因拷貝數(shù)不同，這就需要對得到的16S copies數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)矯正。rrnDB 數(shù)據(jù)庫，全稱ribosomal RNA operons (rrn) DataBase，是一個(gè)收集了NCBI全基因組數(shù)據(jù)中細(xì)菌和古菌的16S基因拷貝數(shù)的數(shù)據(jù)庫，但是目前rrnDB數(shù)據(jù)庫收錄的數(shù)據(jù)有限，無法得到所有物種的拷貝數(shù)信息，而天昊生物基于創(chuàng)新算法可以得到所有物種的拷貝數(shù)信息，從而提取OTU對應(yīng)的16S基因拷貝數(shù)信息，矯正OTU拷貝數(shù)，經(jīng)過矯正后的OTU絕對拷貝數(shù)更接近微生物物種的細(xì)胞數(shù)，基于矯正過的16S基因拷貝數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的生信分析結(jié)果更加真實(shí)可靠。

問答5

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絕對定量分析得到的結(jié)果在和代謝組聯(lián)合分析方面有什么優(yōu)勢?

通過絕對定量分析可以得到物種的絕對豐度，而目前代謝組中的靶向代謝組和全靶代謝組得到的是代謝物的絕對濃度，但是目前微生物組和代謝組的聯(lián)合分析往往基于物種相對豐度和代謝物絕對濃度來進(jìn)行相關(guān)性分析，這顯然會造成錯(cuò)誤的結(jié)論，因此強(qiáng)烈推薦基于物種絕對豐度和代謝物絕對濃度進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)性分析，這樣得到的結(jié)果顯然更加真實(shí)可靠。

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