天昊目的區(qū)域甲基化測序在不同研究領域客戶文章集錦

發(fā)稿時間：2020-09-30來源：天昊生物

截止到2020年9月，
天昊MethylTarget^?技術已經(jīng)完成252個項目

  對于DNA目的區(qū)域甲基化水平的檢測，目前市場上有各種技術平臺，但是不同技術均有各自的技術痛點，要么成本高（目的區(qū)域液相芯片捕獲），要么不能準確定量研究（MSP/BSP），要么操作復雜、不具有單堿基分辨率（色譜、質譜），無法獲得甲基化單倍型（焦磷酸測序）。而天昊生物的多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術MethylTarget^?針對這些核心痛點，不但從技術策略及生信分析方面創(chuàng)新性地解決了上述技術難題，還有更多應用優(yōu)勢：

※ 性價比高：傳統(tǒng)克隆測序一個片段10個克隆的價格，MethylTarget^?可以完成約60個片段的檢測（檢測深度為1000X，相當于1000個克?。?；

※ 精確度高：基于二代測序數(shù)據(jù)檢測甲基化程度，精確到單堿基分辨率，與全基因組甲基化測序，RRBS數(shù)據(jù)，甲基化芯片數(shù)據(jù)有高度一致性；

※ 準確定量：測序深度高達1000X，并可以進一步加深，相比于傳統(tǒng)克隆測序，可以對位點甲基化程度進行準確定量；

※ 技術靈活：基于多重PCR對目標區(qū)域進行富集，可隨時應對基因和位點的變化和改動，并且可以獲得每個片段的甲基化單倍型。

MethylTarget^?技術自服務市場以來，其準確性和性價比優(yōu)勢快速獲得了大量課題組的認可。

優(yōu)秀的技術平臺結合課題組的專業(yè)研究思路，已經(jīng)快速轉化為一大波優(yōu)質SCI文章，下面按不同研究領域分別向大家介紹：

蘇州大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生學院遺傳流行病與基因組學研究中心雷署豐教授團隊文章《外周血單個核細胞中類風濕性關節(jié)炎相關的DNA甲基化位點》發(fā)表在Annals of the Rheumatic Diseases (IF：16.102)。

作者首先利用甲基化450K芯片和LncRNA&mRNA Human Gene Expression MicroarrayV.4.0芯片對43例樣本中外周血單個核細胞的基因組甲基化水平和RNA表達水平進行檢測 (RA：healthy = 25：18)，然后基于甲基化數(shù)據(jù)和表達量數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析和甲基化的因果推理測試，構建差異甲基化基因調(diào)控網(wǎng)絡。利用天昊生物MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術在驗證階段的樣本中檢測10個DMP的甲基化水平，繼而對經(jīng)驗證的PARP9基因在Jurkat 細胞中進行相關的細胞學功能實驗。

上海復旦大學生科院王久存教授課題組文章《全基因組DNA甲基化研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化癥患者CD4⁺和CD8⁺ T細胞的干擾素相關基因表現(xiàn)低甲基化狀態(tài)》發(fā)表在The Journal of Investigative Dermatology (IF：7.143)。

首先利用全基因組甲基化芯片檢測確定差異甲基化位點，GO富集分析發(fā)現(xiàn)干擾素相關通路基因在2種T細胞的DMR中都顯著富集。利用天昊生物MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術檢測第一階段的部分樣本，表明450K甲基化檢測芯片和目的區(qū)域甲基化技術結果的一致性非常好，Pearson相關性高達86%和90%。目的區(qū)域甲基化技術在獨立的樣本中驗證第一階段獲得的干擾素信號通路基因（16個基因；62個位點），其中5個基因的差異甲基化得到驗證。通過檢測干擾素信號通路基因的表達量，部分基因的表達量與甲基化程度表現(xiàn)顯著的負相關。通過檢測血液 IFN-a、IFN-b水平，發(fā)現(xiàn)部分干擾素信號通路基因高表達與高IFN-a、IFN-b水平相關。

蘇州大學醫(yī)學院王明華教授和上海復旦大學生科院王久存教授在食管鱗狀細胞癌DNA甲基化方向文章兩連發(fā)，Clinical Epigenetics (IF：5.028)；Frontiers in Genetics (IF：3.258)。

TCGA數(shù)據(jù)庫來源的84例ESCC腫瘤組織和16例癌旁組織甲基化檢測數(shù)據(jù)作為發(fā)現(xiàn)階段，來源于GEO的4例ESCC腫瘤組織和8例對照的甲基化芯片檢測數(shù)據(jù)作為驗證階段，確定了5個潛在DNA甲基化biomarker，這5個區(qū)域在ESCC腫瘤組織中表現(xiàn)為高甲基化，且在正常人的外周血單核白細胞和外周血白細胞中表現(xiàn)低甲基化。依據(jù)這5個區(qū)域甲基化程度建立的預測模型，對腫瘤和癌旁具有良好的區(qū)分特性（sensitivity = 0.89, specificity = 0.81, AUC = 0.87）。在本實驗收集的94對癌和癌旁組織中，采用MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術驗證甲基化程度，進一步驗證了該模型的效力（實驗設計流程圖如下左圖）。

作者同樣基于文獻檢索和數(shù)據(jù)庫信息篩選了65個候選的腫瘤抑癌基因作為潛在DNA甲基化biomarker，然后利用MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術在94對ESCC癌和癌旁組織中對經(jīng)篩選的6個基因進行甲基化水平驗證，ADHFE1、EOMES、SALL1和TFPI2被驗證，而且在ESCC樣本中表現(xiàn)為顯著的高甲基化?；谶壿嫽貧w的預測模型具有中等的ESCC分類性能（sensitivity = 0.66, specificity = 0.87, AUC = 0.81）。因此這一數(shù)據(jù)表明ADHFE1、EOMES、SALL1和TFPI2的甲基化panel可能是一種有效的基于甲基化的ESCC診斷方法（實驗設計流程圖如下右圖）。

浙江大學朱益民教授課題組和來茂德教授課題組文章發(fā)表在Epigenomics (IF：4.112)上，利用基因甲基化水平建立了一種區(qū)分正常和腫瘤組織的新型結直腸癌鑒別模型。

作者首先從文獻中檢索CRC相關的甲基化調(diào)控基因，基于TCGA數(shù)據(jù)庫中373例樣本的甲基化數(shù)據(jù)和RNA表達數(shù)據(jù)，驗證候選基因啟動子區(qū)域和第一外顯子中CpG位點的甲基化水平，并基于LASSO算法進一步篩選候選基因和CpG位點。隨后在94例中國CRC樣本中進行候選基因和CpG位點驗證（天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法），基于LASSO算法建立基于甲基化水平的CRC鑒別模型，并在TCGA數(shù)據(jù)和CRC患者數(shù)據(jù)中對診斷模型進行評估。

中南大學湘雅三醫(yī)院胃腸外科李小榮教授課題組在Frontiers in Oncology (IF：4.848)雜志上報道了多個基因的啟動子甲基化和結直腸癌臨床病理特征的相關性。

作者試圖在結直腸癌(CRC)數(shù)據(jù)庫和他們的CRC隊列的基礎上找到理想的表觀遺傳基因參與CRC。在最新的數(shù)據(jù)庫中，CRC中極高頻率高甲基化的前20個基因被鑒定出來。然后利用天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法在成對的結直腸腫瘤樣本、癌旁樣本和四種CRC細胞系中驗證HOXA5, HOXA2和HOXA6基因甲基化水平。結果表明，CRC組織和細胞在3個HOXA基因啟動子區(qū)域具有更高的甲基化水平。HOXA基因的ROC曲線在區(qū)分健康個體和CRC患者組織方面表現(xiàn)出良好的診斷能力，特別是對于I期患者。對HOXA基因的甲基化模式與臨床指標進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)HOXA2甲基化與年齡、淋巴轉移（N）、分期、遠端轉移（M）、淋巴血管侵犯、周圍神經(jīng)侵犯、淋巴結數(shù)目顯著相關。HOXA5甲基化與年齡、T、M、分期和腫瘤狀態(tài)相關，HOXA6甲基化與年齡和KRAS突變相關。

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科尹瑞興教授課題組在Aging (IF：4.831)雜志報道了《整合DNA甲基化和基因表達分析冠狀動脈疾病的發(fā)病機制》。

作者進行了(1)外周血樣本的全基因組DNA甲基化和mRNA表達譜分析，這些數(shù)據(jù)來自CAD樣本和對照組的GEO數(shù)據(jù)；(2)功能富集分析和差異甲基化基因調(diào)控網(wǎng)絡構建；(3) 11個感興趣的差異甲基化位點及其基因表達的驗證試驗（天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法）；(4) DNA甲基化與mRNA表達數(shù)據(jù)的相關性分析。結果發(fā)現(xiàn)冠心病組中CXCL12低甲基化較少，而ITGB1、PDGFRB、PIK3R1的相對表達較低，CXCL12、ITGB1的甲基化與表達呈負相關。本研究明確了DNA甲基化與基因表達的相關性，并強調(diào)了CXCL12在CAD發(fā)病機制中的重要性。

南京大學醫(yī)學院金陵醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科徐格林教授課題組發(fā)現(xiàn)CDKN2B甲基化增加了主動脈弓鈣化的風險，相關研究結果發(fā)表在J Atheroscler Thromb (IF：3.876)。

研究選擇缺血性腦卒中患者322例，其中存在主動脈弓鈣化患者248例，無主動脈弓鈣化患者74例。利用MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術檢測患者血液樣本CDKN2A/2B啟動子區(qū)CpG島甲基化水平(共36個CpG位點)。結果發(fā)現(xiàn)動脈鈣化患者CDKN2B甲基化水平顯著高于不存在鈣化的缺血性腦卒中患者；CDKN2B甲基化水平與患者動脈鈣化指標對數(shù)轉換成正相關（矯正rs4977574的影響）。因此，CDKN2B高甲基化可能提示缺血性腦卒中患者有更高的動脈弓鈣化風險。

浙江大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科謝立平和劉犇團隊發(fā)現(xiàn)CCND1, NOP14和DNMT3B參與膀胱癌中miR-502-5p介導的細胞遷移和增殖抑制，論文發(fā)表在Cell Proliferation (IF：5.753)。
MiR-502-5p在膀胱癌中經(jīng)常下調(diào)，同時CpG島的高甲基化（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法）導致miR-502-5p的下調(diào)。在功能上，過表達miR-502-5p在體外抑制細胞增殖和遷移，在體內(nèi)抑制腫瘤生長。CCND1、DNMT3B和NOP14被鑒定為miR-502-5p的直接靶點。有趣的是，DNMT3B和miR-502-5p在膀胱癌調(diào)控中建立了正反饋回路。此外，rescue實驗進一步驗證了miR-502-5p與其靶點之間的直接分子相互作用。這項研究提出并證明了miR-502-5p介導的調(diào)控網(wǎng)絡在膀胱癌中至關重要。

浙江大學第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科鄭樹森院士團隊和張微教授團隊發(fā)現(xiàn)SOCS1通過降低細胞核中CyclinD1/CDK4復合物的穩(wěn)定性來阻斷肝細胞癌中G1-S期過渡，論文發(fā)表在Aging (IF：4.831)。

CDK蛋白家族的抑制劑已被批準用于多種腫瘤的治療。然而，開發(fā)新藥物聯(lián)合CDK抑制劑有望提高治療效果。作者鑒定了細胞因子信號通路1 (SOCS1)抑制因子在肝細胞癌(HCC)細胞模型和異種移植小鼠模型中的作用。多個HCC細胞中SOCS1的甲基化水平顯著增加（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法），導致其表達水平下降。當人為上調(diào)SOCS1表達時，HCC細胞系在細胞周期G1-S過渡時被阻滯。有趣的是，在此過程中，CyclinD1總蛋白增加，但有效比例下降。進而發(fā)現(xiàn)CyclinD1在細胞核中的缺失可能是由于P21的基于泛素降解導致細胞核CyclinD1的穩(wěn)定性下降，從而抑制了細胞周期向S期的發(fā)展。當P21表達增加后，抑制CyclinD1活性的成分水平如預期的一樣下降，說明P21對腫瘤有部分促進作用。SOCS1是預后、腫瘤大小和術后長期生存的良好指標。SOCS1有望與CDK家族抑制劑聯(lián)合成為藥物靶點。

湖南師范大學醫(yī)學院李健老師課題組發(fā)現(xiàn)父方孕前不良飲食習慣對女性后代的代謝損傷影響可被雌性大鼠孕期葉酸治療過程逆轉，Diabetologia (IF：7.518)。

作者發(fā)現(xiàn)對于父方高脂-糖-鹽飲食組，其雌性后代表現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受損傷，可能是肝組織一些關鍵代謝基因表達異常的外在體現(xiàn)。對于父方高脂-糖-鹽飲食組，其后代表現(xiàn)整體甲基化上升，但一些代謝核心基因的甲基化水平并無顯著變化（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法）。雄性大鼠孕前不良飲食習慣對女性后代的代謝損傷影響可被雌性大鼠孕期葉酸治療過程逆轉。因此該研究提示母親孕期服用葉酸，可能能夠改善和治療父方孕前快餐飲食習慣對子代造成的表觀遺傳學不良影響。

浙江中醫(yī)藥大學江阿沛教授課題組發(fā)現(xiàn)DNA甲基化參與了治療雌性系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠白芍總苷調(diào)控ERα，Journal of Pharmacological Sciences (IF：2.835)。

白芍總苷(TGP)是從白芍根部提取的生物活性化合物，已用于治療自身免疫性疾病。但TGP在自身免疫性疾病治療中的分子機制尚不清楚。ERα在SLE疾病中有促炎作用。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)TGP通過上調(diào)ERα啟動子甲基化水平（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法），顯著降低了ERα的表達。進一步的研究表明，TGP治療可以增加狼瘡小鼠DNMT的表達。另外還使用了DNA甲基轉移酶抑制劑來驗證DNA甲基化是否參與了這些過程。HE染色結果顯示，TGP可減輕SLE小鼠腎損傷。TGP可抑制血清中IFN-g、IL6、IL12等細胞因子的表達及dsDNA水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，TGP在SLE小鼠中抑制自身免疫可能是通過下調(diào)ERα的表達，而這可能是由于其能夠調(diào)節(jié)ERα啟動子的甲基化狀態(tài)。

南京農(nóng)業(yè)大學動物生理生化重點實驗室趙茹茜教授課題組于2017年12月在《Poultry Science》雜志（IF：2.659）上發(fā)表了補充甜菜堿促進蛋雞類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白和卵黃沉積腎上腺皮質酮表達的文章，在這項研究中使用了目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法。

課題組利用MethylTarget^?技術同年又在《Comparative Biochemistry and Physiology》雜志（IF：2.219）雜志上發(fā)表了母雞補充甜菜堿通過DNA甲基化修飾來調(diào)控F1代公雞下丘腦膽固醇代謝相關基因表達的文章。

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